Nous avons développé un nouveau modèle de sphéroïdes 3D qui offre une plate-forme pour étudier les interactions cancer-stroma et pour tester les thérapeutiques contre le cancer. À mon avis, ce système 3D combine les cellules cancéreuses dans un fibroblaste stroma pour mieux imiter les conditions tumorales authentiques et peut, par conséquent, être un outil très puissant pour la découverte de médicaments. De plus, ce modèle ne se limite pas à l’étude du mélanome.
Il peut être utilisé pour étudier d’autres types de cancers. Le Dr Hongwei Shao, scientifique principal de mon labo, démontrera la procédure. Pour la culture cellulaire du mélanome humain, jetez les cellules dans des conditions conventionnelles de culture cellulaire adhérente et complétez le milieu W489 à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone à 5 %.
Lorsque les cellules atteignent 90% de confluence, divisez les cellules à un rapport d’un à cinq. Pour la culture fibroblaste de peau de souris, lavez les granules récoltés de tissu dans PBS avant de culturiser les spécimens et DMEM complété avec le sérum bovin foetal de 10 pour cent, et un pour cent pénicilline-streptomycine dans l’incubateur de culture cellulaire. Divisez les cellules à un rapport un à deux lorsqu’elles atteignent une confluence de 90 %.
Avant de mettre en place les cocultures, les fibroblastes de graines sur un plat de 100 millimètres à une concentration telle que la confluence cellulaire atteindra environ 60 pour cent le lendemain. Le lendemain matin, remplacez le supernatant par une concentration de 1 à 3 à 1 à 5 de GFP au lentivirus dilué du stock dans le milieu de culture régulier complété par quatre microgrammes par millilitre de polybrene. Placez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant six heures avant de remplacer le supernatant par un milieu de culture frais.
Après deux jours, observez le signal GFP des cellules au microscope à fluorescence. Lorsque les deux cultures cellulaires ont été habilement transfectées, détachez les deux cultures cellulaires de 0,25 trypsine-EDTA pour recueillir les suspensions cellulaires simples par centuvigation. Suspendre à nouveau les cellules à deux fois 10 à quatre cellules par millilitre de la concentration moyenne de coculture et mélanger les cellules du mélanome et les fibroblastes à un rapport un pour un.
Ensuite, voir deux millilitres de cellules à chaque puits d’une plaque de puits 24 et triplicate pour chaque condition et placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant quatre heures pour permettre aux cellules de s’attacher au fond de la plaque. Pour la culture solo de cellules de mélanome pour évaluer la formation de faisceau de cellules 2D, voyez deux fois 10 aux quatrièmes cellules de mélanome dans chaque puits d’une plaque de puits 24 et la culture des cellules pendant sept à 10 jours dans l’incubateur de culture cellulaire. Photographiez ensuite les cellules sur un microscope à fluorescence inversé selon les protocoles de microscopie fluorescente standard.
Si le système d’imagerie time lapse est éteint, allumez-le au moins une heure avant l’imagerie. Lorsque le système est prêt, transférez soigneusement la plaque de culture au stade du microscope et faites glisser l’incubateur et verrouillez solidement la porte. Ouvrez le logiciel du système d’imagerie time lapse et cliquez sur ajouter navire pour sélectionner le type de plaque et le fabricant afin que le microscope peut localiser la zone de balayage avec précision.
Sélectionnez une lentille 10 fois objective et les puits d’intérêt et définissez les paramètres de la zone de numérisation, le temps d’intervalle entre les analyses et une heure de début et de fin. Enregistrez ensuite l’imagerie par laps de temps de quatre à 52 heures. À la fin de l’enregistrement d’images, utilisez le logiciel de système d’imagerie time lapse pour récupérer les données et exporter les vidéos ou ensembles d’images collectés.
Pour l’imagerie par microscopie confocale des cocultures, placez la plaque sur la scène d’un microscope à fluorescence inversé et sélectionnez les faisceaux laser rouges et verts. Observez les cellules sous un objectif de cinq ou dix fois et sélectionnez le sphéroïde pour commencer à scanner. À l’aide d’un z-step d’un micron, numériser du bas vers le haut du sphéroïde.
Traitez ensuite les données à l’aide du logiciel de traitement d’image approprié pour reconstruire une image 3D qui peut être encore tournée et sauvegardée sous forme de film 3D. Ici, des images de sphéroïdes 3D multicellulaires formés par des cellules de mélanome coculturel et des fibroblastes sont montrées. Les cellules mélanomes cultivés en l’absence de fibroblastes ne forment pas de sphéroïdes 3D typiques, bien que certaines cellules du mélanome forment des grappes 2D avec une culture étendue.
Utilisant l’imagerie de laps de temps, des fibroblastes et des cellules de tumeur peuvent être observés interagissant dans la coculture, commençant à partir des sphéroïdes à environ 36 heures. Dans ce film, le processus dynamique de formation d’agrégats cellulaires de mélanome à culture unique de quatre à 52 heures de culture peut être observé. Ici, une structure sphéroïde 3D peut être observée par microscopie confocale après sept jours de culture, tandis que dans ce film, un cluster cellulaire 2D peut être visualisé.
Les sphéroïdes 3D restent suspendus dans le milieu de culture et sont mobiles, tandis que les amas de cellules tumorales 2D ont tendance à s’attacher à la plaque de culture et sont immobiles. Ce modèle 3D sert de plate-forme unique pour étudier les interactions tumeur-stroma. Par exemple, pour élucider comment l’activité intercellulaire de voie de signalisation Notch1 et les fibroblastes associés au cancer régulent la tige du cancer et la formation de cellules et de sphéroïdes d’initiation.
En outre, ce modèle peut être utilisé pour tester les réponses médicamenteuses de la tige du cancer et des cellules initiatrices. Bien que cette méthode soit simple et simple, prenez soin d’utiliser la densité cellulaire correcte et le rapport cellulaire, et d’utiliser les plaques de culture appropriées comme démontré. Ce modèle 3D peut également être appliqué pour sédation de l’activité cruciale de voie de signalisation intracellulaire pour déterminer les phénotypes des cellules souches cancéreuses ainsi que pour le criblage de composés de petites molécules auxquels les cellules souches cancéreuses sont très sensibles.
