This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.

1. Génération de reproductible Sphéroïdes tumorales Sized <ol><li> Laver les monocouches de cellules tumorales avec un tampon phosphate salin (PBS, 5 ml d&#39;une 25 cm 2 ou 8 à 10 ml pour un 2 flacon de 75 cm), ajouter dissociation cellulaire enzymatique (1 ml pour 25 cm 2 ou 2 ml d&#39;une 75 cm 2 fiole) et on incube les cellules à 37 ° C pendant 2-5 min. </li><li> Vérifier le détachement des cellules au microscope et neutraliser la dissociation enzymatique des cellules avec du milieu de croissance complet (5 ml pour une 25 cm 2 ou 8 ml pour un flacon de 2 75 cm). </li><li> Centrifugeuse suspension de cellules à 500 g pendant 5 min. </li><li> Retirer le surnageant, tapoter le tube et remettre en suspension culot cellulaire dans 1 ml de milieu de croissance complet en utilisant une pipette P1000. Cela devrait donner une suspension de cellule unique sans amas de cellules. </li><li> Compter les cellules à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre et on dilue la suspension de cellules pour obtenir de 0,5 à 2 x 10 4 cellules / ml (densité cellulaire optimale doit être déterminée pour chaque lignée cellulaire en order pour obtenir des sphéroïdes tumoraux de 300 à 500 um diamètre de 4 jours après l&#39;ensemencement cellulaire 12,13). </li><li> Transférer la suspension cellulaire à un réservoir stérile et, à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux, distribuer 200 pl / puits dans ultra-faible attachement (ULA) plaques à 96 puits à fond rond 12. </li><li> Transférer les plaques dans un incubateur (37 ° C, 5% de CO2, 95% d&#39;humidité). Quatre jours plus tard, confirmer visuellement la formation sphéroïde de la tumeur et de procéder à l&#39;essai d&#39;invasion 3D. </li></ol> 2. 3D tumeur Spheroid Invasion Assay <ol><li> Décongeler BMM sur la glace. </li><li> Gardez un ensemble de bouts filtres stériles pour P10, P200 et P1000 pipettes et tubes stériles (1,5 ml de volume ou plus en fonction du volume total requis) à -20 ° C. </li><li> Placez les ULA plaques à 96 puits contenant âgées de 4 jours sphéroïdes sur la glace. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, retirez délicatement 100 pl / puits de milieu de croissance à partir des plaques de sphéroïde. Pour cette angle de pas les conseils vers le inside paroi des puits à fond en U, en évitant tout contact avec le fond du puits et l&#39;emplacement des sphéroïdes; minimiser la perturbation des sphéroïdes. </li><li> En utilisant des pointes glacées, transférer BMM à tubes glacés. Pour invasion induite par les cytokines ou pour des études d&#39;évaluation des médicaments, ajoutera des réactifs (à 2x la concentration finale) à l&#39;aide de conseils BMM glacées. Par exemple, utiliser le facteur de croissance épidermique (EGF) pour stimuler l&#39;invasion des cellules de carcinome épidermoïde CAL S et R CAL. Bien mélanger en agitant doucement, en évitant la formation de bulles. </li><li> Passer doucement 100 pi de BMM dans le puits à fond en U, visant la pointe vers la paroi intérieure du puits. Cette étape est la plus critique que, par analyse d&#39;image optimale, des sphéroïdes doivent rester dans le centre du puits 12. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.6 pour tous les puits nécessaires, permettant 5-6 répétitions / état. Si nécessaire, changez à une pointe fraîchement réfrigérés. REMARQUE: Lorsque plus expérimenté, DISPENBMM soi à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux. </li><li> Utiliser une aiguille stérile, enlever les bulles, si elle est présente. <ol><li> En utilisant un microscope, vérifier visuellement que sphéroïdes sont dans une position centrale. Si non, centrifuger la plaque à 300 g pendant 3 min à 4 ° C. Cela permettra d&#39;assurer que les sphéroïdes sont situés au centre de chaque puits. </li></ol></li><li> Transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C et laisser se solidifier le BMM. </li><li> 1 h plus tard, à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux, ajouter doucement 100 ul / puits de milieu de croissance complet. Pour invasion ou d&#39;évaluation des médicaments études induite par des cytokines, inclure des cytokines ou des inhibiteurs dans le milieu (1x concentration finale). Alternativement, si les réactifs ne sont pas ajoutés à la BMM à l&#39;étape 2.5, ajoutez-les au milieu à ce point (3x la concentration finale souhaitée). </li></ol> 3. automatisé Image Acquisition <ol><li> Plaques de numérisation sur le cytomètre (pour spécifications, voir le tableau de l&#39;équipement et des matériaux) à intervalles starter de temps zéro (t0 = jour de l&#39;essai d&#39;invasion mis en place, immédiatement après l&#39;étape 2.10 jusqu&#39;à 72 h ou 96 h pour les lignes d&#39;invasion de cellules tumorales plus lents. </li><li> Sélectionnez l&#39;application «Confluence». </li><li> Vérifiez que le sphéroïde est au point et, si nécessaire, régler et modifier manuellement le «Focus off-set». </li><li> Sous la rubrique «paramètres échantillonnage», sélectionnez pour balayer une zone centrale de vision (FOV). Après l&#39;addition BMM, sphéroïdes tumoraux auraient dû rester dans une position centrale, il n&#39;y a donc pas besoin de balayer l&#39;ensemble bien. </li><li> Dans le logiciel, définissent les puits pour être numérisés en les sélectionnant sur la carte de la plaque. Cliquez sur &quot;Lancer la numérisation &#39;. REMARQUE: La numérisation est automatiquement sauvegardé et peut être revue ultérieurement hors ligne. </li></ol> 4. Analyse d&#39;image automatisé <ol><li> Sélectionnez l&#39;application «Confluence». </li><li> Dans l&#39;onglet &#39;Analyse de, ajuster applicparamètres de ation (par exemple, «précision»: bas haut, normal,; &quot;seuil d&#39;intensité&quot;: 1 - 15) pour produire une segmentation précise autour de la sphéroïde, y compris les processus cellulaires et invadopodia étendant dans le BMM (voir Figure 1). Régler les paramètres de chaque lignée de cellules de tumeur et / ou à différents points dans le temps. Mesures d&#39;application de la «Confluence» de l&#39;% de la superficie de bien couverts par les cellules envahissantes, dans le FOV sélectionné. </li><li> Vérifiez que les paramètres d&#39;analyse sont appropriées (par exemple, la segmentation est exacte) pour les autres sphéroïdes dans la plaque en cliquant sur ​​quelques puits différents. Si la segmentation ne précise pas exactement un sphéroïde, ajuster les paramètres de l&#39;application plus loin. </li><li> Cliquez sur &quot;Lancer l&#39;analyse&quot;. </li><li> Dans l&#39;onglet &quot;Résultats&quot;, vérifier plusieurs puits pour vérifier la qualité de l&#39;analyse. Export &#39;Eh bien les données de niveau »à un tableur. </li><li> REPEAanalyse de t pour tous les points dans le temps. Calculer la moyenne% de confluence pour les puits répétés et l&#39;invasion de la parcelle (% de confluence) contre le temps dans un graphique à barres, à l&#39;aide de graphiques scientifique et logiciel statistique de choix. </li></ol> 5. Acquisition manuel de l&#39;image <ol><li> Enregistrer une image pour chaque sphéroïde de tumeur à des intervalles à partir de t = 0 jusqu&#39;à 72 à 96 heures, en fonction de la vitesse de l&#39;invasion de la lignée cellulaire en question, en utilisant un microscope inversé (pour une plaque de 96 puits cela prend environ 20 - 30 min). Utilisez un objectif 10X. Utilisez un objectif 4X quand une zone envahie est trop grande pour être complètement capturé dans le champ 10X de vue. </li><li> Enregistrer chaque image acquise. </li><li> Pour l&#39;étalonnage, prendre des images d&#39;un réticule de l&#39;étape (1 mm) en utilisant les deux objectifs 10X et 4X (et enregistrer des images). </li></ol> 6. Manuel Analyse d&#39;Image <ol><li> Ouvrez les images du réticule de la scène dans le logiciel d&#39;analyse d&#39;image de votre choix. </li><li> Entrez le gratmesures icule, les unités (um), les objectifs utilisés (10X ou 4X) et d&#39;effectuer l&#39;étalonnage. Cette étape est nécessaire qu&#39;une seule fois. Pour l&#39;analyse de l&#39;image suivante, rechargez simplement les paramètres de calibrage requis. </li><li> Ouvrez les images de dosage d&#39;invasion et sélectionnez les paramètres d&#39;étalonnage en fonction de l&#39;objectif du microscope (10X ou 4X) utilisé pour obtenir les images. <ol><li> Alternativement, importer des images obtenues sur un cytomètre imagerie (étape 3) et d&#39;analyser manuellement, comme décrit pour les images obtenues à l&#39;aide d&#39;un microscope inversé (voir résultats de la figure 3 et la figure 4). </li></ol></li><li> Mesurer la zone couverte par les sphéroïdes. <ol><li> Dans le logiciel utilisé ici pour les résultats représentatifs (pour spécifications, voir le tableau de l&#39;équipement et des matériaux), aller à «Mesure» et sélectionnez «comte / size &#39;. Choisissez «Fichier» puis «Charger les paramètres &#39;et sélectionnez pré-déterminée assaparamètres y. Ensuite, choisissez &quot;Count&quot;. Le sphéroïde devrait alors être segmenté avec précision. </li><li> Sinon aller à &quot;Modifier&quot;, puis &quot;Dessiner / fusionner des objets &#39;pour ouvrir la fenêtre&quot; Magic Wand / Trace &quot;. Utilisez le curseur de la baguette de cliquer sur l&#39;image sphéroïde et d&#39;obtenir la segmentation. Sélectionnez &#39;Trace&#39; (dans la fenêtre &#39;Magic Wand &quot;) pour décrire manuellement le sphéroïde aide d&#39;une souris. </li></ol></li><li> les mesures à l&#39;exportation de différents paramètres (surface, diamètre, le périmètre etc.) à une feuille de calcul. Enregistrer sur la feuille de calcul des informations d&#39;image pertinente (par exemple, nombre bien, point de temps relatif). </li><li> Tracer la surface moyenne de sphéroïdes répétées (de l&#39;invasion) en fonction du temps à l&#39;aide de graphiques scientifiques et des logiciels statistiques. Alternativement, calculer la variation dans la zone sphéroïde à chaque point de temps, par rapport à la zone à t = 0. Alors invasion de la parcelle (% t0) en fonction du temps comme un gra linéaireph. </li></ol>

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Tous les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêt en concurrence.

Les deux modèles de tumeurs décrites ici (glioblastome et SCCHN) ont été spécifiquement choisis pour illustrer notre test de 3D ​​comme ils sont cliniquement cancers localement invasives pertinents ayant un besoin non satisfait de thérapies efficaces 12. Suite à un traitement médicamenteux, l&#39;évaluation de vitro changements de pharmacodynamique (PD) de biomarqueurs peut être effectuée facilement par blot ou analyses immunologiques de lysats western suite à l&#39;utilisation de réactifs disponibles dans le commerce spécifiques pour permettre la récupération des cellules à partir de BMM et / ou l&#39;analyse par immunofluorescence de l&#39;invasion des sphéroïdes de tumeur par toute coloration monture. Cet essai d&#39;invasion est une technique utile pour l&#39;évaluation rapide et reproductible de l&#39;invasion des cellules tumorales dans un milieu semi-solide et donc particulièrement approprié pour l&#39;avenir dans le dépistage de la drogue vitro. Les cellules cancéreuses envahissent la matrice 3D d&#39;une manière qui se propagent à partir d&#39;un &quot;micro-tumeur», représentée par le sphéroïde de tumeur, et se prolongent dans une extracellulenvironnement matriciel comme ar. Le vrai tridimensionnalité de l&#39;essai est évident dans la morphologie cellulaire, qui est différente de la morphologie des cellules adhérentes plat supposent lors du déplacement sur un substrat solide. Le degré d&#39;invasion est facilement quantifiée en utilisant soit un cytomètre de formation d&#39;image, ce qui permet une lecture automatique, ou en utilisant un microscope standard en combinaison avec un logiciel d&#39;imagerie. En outre, cette méthode est adaptée pour l&#39;imagerie de fluorescence 13 (par exemple avec des lignées cellulaires exprimant des protéines fluorescentes ou pré-marqués avec des colorants fluorescents). Le procédé est simple à réaliser avec la seule étape critique représenté par l&#39;addition du BMM, quand il existe un risque de perturber la position centrale de l&#39;ellipsoïde dans le puits en forme de U. Cela peut se traduire par analyse d&#39;image optimale, avec des sphéroïdes dans différents plans focaux. Il est donc essentiel d&#39;ajouter le BMM soigneusement et lentement à chaque puits. Après addition BMM il est conseillé de consulter la plaquesous un microscope et si la localisation est considéré comme inacceptable, on peut y remédier par centrifugation douce. Avec l&#39;expérience, ce qui est rarement nécessaire. Alors que cette méthode est robuste et très reproductible, la variation inter-expérimentale pourrait se produire avec différents lots de BMM. Pour éviter cela, il est conseillé d&#39;acheter suffisamment de BMM à partir d&#39;un seul lot pour compléter une série d&#39;études. Une limitation de la méthode (comme pour toutes ces essais) est la difficulté de distinguer entre l&#39;invasion et la prolifération, qui les cellules tumorales subissent probablement au cours de la période d&#39;essai. Bien que le temps de doublement des cellules peut être prise en compte, ou des inhibiteurs du cycle cellulaire tels que la cytochalasine D a introduit, il est difficile de contrôler ou de clairement distinguer entre ces deux aspects différents de progression tumorale, en particulier pour les cellules tumorales en croissance rapide et pour ceux qui avoir un motif d&#39;invasion plus &quot;large&quot;, plutôt que d&#39;infiltration. Pour cette raisonil est suggéré que le test de croissance 3D parallèle est effectué pour évaluer les effets spécifiques de tous les agents inhibiteurs ou stimulants. Si les études de dose-réponse attention sont effectuées, il peut être possible de sélectionner les concentrations qui minimisent les effets sur la prolifération. Par exemple, nous avons montré que l&#39;inhibiteur de HSP90 17-AAG inhibe U-87 MG 3D invasion de sphéroïde de tumeur déjà à 24 h et à des concentrations inférieures à la concentration inhibant la croissance de 50% en 3D (GI 50) 12. D&#39;autre part, l&#39;importance de ce test par rapport à d&#39;autres essais d&#39;invasion standard (par exemple, filtres à base de dosages ou l&#39;invasion des cellules individuelles dans des matrices 3D 1), est que les cellules tumorales envahissent la matrice environnante de la sphéroïde, qui ressemble à un &quot; micro-tumorale &quot;ou un&quot; micro-métastases &quot;, et prend donc en compte les aspects importants de la physiopathologie d&#39;une masse tumorale. La méthode que nous présentons fournit des informations sur lacomportement collectif des cellules tumorales, au moment de quitter d&#39;abord les sphéroïdes, et aussi séparément, lorsque les cellules simples atteindre des régions plus éloignées dans le BMM. En outre, les cellules tumorales à l&#39;intérieur des sphéroïdes peuvent subir une hypoxie et nutritif privation qui, grâce à des changements dans l&#39;expression génique, peut favoriser la migration et l&#39;invasion; ces caractéristiques sont absentes dans les analyses 2D. En outre, tout cela est disponible dans un format à haut débit à travers l&#39;utilisation des plaques à 96 puits spécifiques et les dernières technologies d&#39;imagerie, permettant un test de 3D plus complexe pour être facilement utilisé dans la validation des cibles et de la découverte de médicaments. La méthode que nous présentons peut accueillir d&#39;autres applications pour traiter des aspects supplémentaires de l&#39;invasion des cellules tumorales. En particulier, la complexité supplémentaire peut être envisagé par l&#39;addition de cellules hôtes, telles que les fibroblastes et / ou des cellules endothéliales, dans la sphéroïde lui-même ou la matrice environnante. Cela peut également être modifié, non seulement en termes de rigidité (par l&#39;utilisation de différents concentrations de BMM), mais aussi en termes de composition (par l&#39;addition d&#39;autres composants à charge spécifique sur le tissu / organe du modèle adopté des tumeurs: par exemple, la ténascine pour les cancers du cerveau et du collagène 16 de carcinome du sein 17). Un set-up (génération de sphéroïdes et imagerie) similaire peuvent également être adaptées pour évaluer l&#39;invasion des tissus en 3D, où sphéroïdes tumoraux sont co-cultivées avec des corps embryoïdes ressemblant à un tissu complexe 12 ou avec d&#39;autres organites cellulaires spécifiques (par exemple, les astrocytes pour gliome 18 ou crypte cultures pour les cancers gastro-intestinaux), mais d&#39;autres travaux sont nécessaires pour permettre l&#39;analyse d&#39;image automatisée.

Classique développement de médicaments anticancéreux est largement axé sur l&#39;utilisation des essais in vitro à base de cellules à l&#39;écran pour les agents cytotoxiques qui inhibent la prolifération cellulaire tumorale et / ou favorisent la mort cellulaire programmée (apoptose). Plus récemment, des efforts ont évolué vers des thérapies ciblées avec le développement d&#39;inhibiteurs des causes moléculaires sous-jacents de la prolifération des cellules malignes. En dépit de quelques résultats spectaculaires, ces agents sont souvent associés avec le développement rapide de la résistance aux médicaments. Étant donné qu&#39;il est le potentiel invasif et métastatique des cellules tumorales qui est responsable de la majorité des décès par cancer, maladie récidivante et qui présente souvent un phénotype plus agressif, il est logique de considérer également complémentaire dans des modèles expérimentaux in vitro pour identifier de nouvelles 1,2 agents qui inhibent ces «caractéristiques» clés supplémentaires de cancer. Au cours de la progression maligne, les cellules tumorales acquièrentla capacité d&#39;envahir les tissus environnants et / ou la propagation dans des organes distants (métastases). Les cellules cancéreuses pénètrent dans la membrane basale par la formation de invadopodia 3,4. Ces structures sont enrichies avec des filaments d&#39;actine, des protéines d&#39;adhérence et de proteinases spécifiques et sont collectivement responsables de la motilité des cellules tumorales et de la dégradation de la matrice extracellulaire (ECM) 5. Invadopodia étendre dans l&#39;ECM et sont jugées importantes pour l&#39;invasion des cellules de la tumeur et une extravasation également dans les canaux vasculaires, facilitant hématogène (ou lymphatique) la diffusion et la métastase. Méthodes standards actuelles pour évaluer l&#39;invasion des cellules tumorales in vitro comprennent ce qui suit. Transwell base d&#39;essais ou de la chambre de Boyden 2,6 où suspensions de cellules isolées sont ensemencées sur un filtre revêtu d&#39;une épaisse couche de protéines de la MEC dérivés. Cellules envahissent ensuite et se déplacent dans la chambre inférieure en réponse à une chimio-attractif. Communément utilisé ECMles protéines sont collagène de type I, ou une membrane analogue à matrice de sous-sol (BMM, par exemple, de Matrigel, dérivé de la tumeur EHS 7) qui imite la composition naturelle de membranes basales. Comme une alternative aux essais de type chambre Boyden à filtre 8, les cellules peuvent être ensemencées sur le dessus d&#39;un gel d&#39;ECM (à laquelle peuvent être ajoutés des fibroblastes), où ils forment une monocouche et ensuite envahir individuellement ou collectivement dans le gel. Invasion peut être mesurée en termes de nombre de cellules et / ou de la distance envahisseurs venus de la surface du gel 9. Les cellules tumorales peuvent également être entièrement noyées dans une matrice soit sous forme de suspension de cellules individuelles ou sous forme de sphéroïdes - habituellement placées entre deux couches de gel-ECM permettant d&#39;envahir les cellules de la masse tumorale dans la matrice environnante 2,6,10,11. Les trois dimensions (3D) sphéroïde de tumeur dosage d&#39;invasion décrite ici fournit un système d&#39;invasion rapide, automatisable utilisant un highly reproductible, méthode standardisée 12 dans un format de plaque de 96 puits avec un sphéroïde par puits. BMM est ajouté directement à chaque puits pour donner une matrice semi-solide dans laquelle les cellules tumorales envahissent du corps sphéroïde. L&#39;étendue de l&#39;invasion des cellules tumorales est surveillé à des intervalles sur une période de 72-96 heures. Cette méthode présente les avantages suivants au cours des essais in vitro courants d&#39;invasion mentionnés ci-dessus: la tumeur des cellules sont organisées en une structure 3D imitant une micro-région de la tumeur ou une micro-métastase; les sphéroïdes tumoraux sont hautement reproductibles en taille; le dosage d&#39;invasion est réalisée in situ dans la même plaque que le développement de sphéroïde de tumeur, sans qu&#39;il soit nécessaire de les déplacer à des plaques secondaires; la méthode, combinée avec les dernières technologies de l&#39;analyse automatique de l&#39;image, permet à la fois de haute teneur et analyse à haut débit de l&#39;invasion des cellules tumorales. L&#39;analyse d&#39;image est réalisée en utilisant un cytomètre imagerie, qui balaye un 96 puitsplaque dans les 10 minutes. En utilisant l&#39;application de confluence, l&#39;étendue et le taux d&#39;invasion atteints soit par des cellules individuelles ou par des amas de cellules étendent depuis les sphéroïdes de tumeur et invasion dans la matrice peut être mesurée de façon dynamique. Pour un débit plus faible, un autre procédé pour l&#39;analyse d&#39;images est présentée, sur la base de l&#39;utilisation d&#39;un microscope inversé et un logiciel d&#39;imagerie standard.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1218">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:297px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Web address</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Corning Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354234</td>
			<td>http://www.corning.com 
			Keep at&#160; 4 &#176;C to&#160; prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear</td>
			<td style="width:161px;">Trevigen</td>
			<td style="width:135px;">3432-005-01</td>
			<td>http://www.trevigen.com 
			Keep at&#160; 4 &#176;C to&#160; prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ultra-low attachment 96-well plate</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">7007</td>
			<td>http://www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:297px;">EGF</td>
			<td style="width:161px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:135px;">130-093-825</td>
			<td>http://www.miltenyibiotec.com 
			Add 100 &#181;l 1% BSA (w/v) in water to 100 &#181;g EGF. To 25 &#181;l of this, add 4,975 &#181;l RHB-A medium to give a 10 &#181;g/ml working stock. Aliquot and store at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">RHB-A medium</td>
			<td style="width:161px;">Stem Cells Inc.</td>
			<td style="width:135px;">SCS-SF-NB-01</td>
			<td>http://www.stemcellsinc.com 
			For diluting EGF</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:297px;">DMEM</td>
			<td style="width:161px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">31966-021</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/ 
			Warm in 37 &#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:161px;">Biosera</td>
			<td style="width:135px;">1001/500</td>
			<td>http://www.biosera.com 
			Heat at 56 &#176;C to inactivate complement before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TrypLE</td>
			<td style="width:161px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">12605</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/ 
			Cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:297px;">Celigo cytometer</td>
			<td style="width:161px;">Nexcelom Bioscience</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.nexcelom.com 
			Specialist equipment for image capture and analysis.&#160; Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">IX70 inverted microscope</td>
			<td style="width:161px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.olympus.co.uk/ 
			Used with camera for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:297px;">Retiga Exi Fast 1394 digital camera</td>
			<td style="width:161px;">Qimaging</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.qimaging.com/ 
			Attached to microscope for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Image-Pro Plus 7.0</td>
			<td style="width:161px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.mediacy.com/ 
			Software used to control camera and microscope for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Image-Pro Analyzer 7.0</td>
			<td style="width:161px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.mediacy.com/ 
			Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Excel 2010</td>
			<td style="width:161px;">Microsoft</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.microsoft.com/ 
			Scientific graphing and statistical software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Prism 6.0</td>
			<td style="width:161px;">GraphPad</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.graphpad.com/ 
			Scientific graphing and statistical software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional (3d) tumor spheroid invasion assay

L&#39;invasion des tissus normaux environnants est généralement considéré comme une caractéristique clé de maligne (par opposition à des tumeurs bénignes). Pour certains cancers, en particulier (par exemple, les tumeurs cérébrales telles que glioblastome multiforme et le carcinome spinocellulaire de la tête et du cou -. SCCHN), il est une cause de morbidité grave et peut être mortelle, même en l&#39;absence de métastases à distance. En outre, les cancers qui ont rechuté après un traitement malheureusement souvent présent avec un phénotype plus agressif. Par conséquent, il est possible de cibler le processus d&#39;invasion de fournir de nouvelles thérapies qui peuvent être complémentaires à des agents anti-prolifératifs standard. Jusqu&#39;à présent, cette stratégie a été entravée par le manque de tests robustes, reproductibles appropriés pour une analyse détaillée de l&#39;invasion et de dépistage de drogue. Ici nous fournissons une méthode micro-plaque simple (basé sur uniforme, auto-assemblage sphéroïdes tumoraux 3D), qui a un grand potentiel pour une telle stumeurt. Nous illustrons la plate-forme de test utilisant une lignée cellulaire de glioblastome humain et également un modèle SCCHN où le développement de la résistance contre le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR ciblé inhibiteurs) est associée à un potentiel de matrice renforcée invasive. Nous fournissons également des deux autres méthodes de quantification semi-automatique: une en utilisant une imagerie cytomètre et un deuxième qui exige simplement la capture de microscopie et de l&#39;image standard avec analyse d&#39;image numérique.

3D sphéroïde invasion tumorale est évaluée en utilisant un reproductible, procédé simple, automatisé illustré schématiquement sur ​​la figure 1: sphéroïdes de tumeur de taille reproductible sont obtenus par étalement des cellules dans ULA plaques à 96 puits à fond rond. 4 jours post-initiation sphéroïdes sont intégrés dans BMM. Ceci permet d&#39;obtenir une structure semi-solide dans laquelle les cellules tumorales envahissent et répartis de la sphéroïde. Sphéroïdes sont situés au centre à la base de chaque puits et l&#39;invasion dans le BMM est aisément contrôlée à intervalles à partir de t = 0 jusqu&#39;à 72 à 96 h en utilisant une imagerie cytomètre. Cela peut fournir entièrement automatisé d&#39;analyse d&#39;image. Des exemples de différents types d&#39;invasion des cellules cancéreuses sont illustrés sur les figures 2 -. 4 Le glioblastome multiforme humain (GBM) lignée de cellules hautement malignes U-87 MG, forme une structure en 3D étanche, de forme sphérique et est utilisée ici pour illustrer des tumeurs du cerveau dans lesquelles locale invasion est une clé mortellefonctionnalité. Une fois incorporé dans BMM, les cellules de sphéroïdes U-87 MG, réparties avec un modèle d&#39;invasion &quot;starburst&quot; typique 12. Les cellules tumorales étendent radialement dans la matrice dans laquelle elles maintiennent une forme à 3 dimensions. Le procédé est suivi sur une période de 72 heures comme représenté sur la Figure 2 pour U-87 MG, des sphéroïdes, lors de la mesure de l&#39;invasion de cellules tumorales, avec des détails sur les processus cellulaires et se prolongeant dans la invadopodia BMM est clairement évidente. Analyse d&#39;image en utilisant un cytomètre d&#39;image permet la quantification précise de l&#39;invasion des cellules tumorales au fil du temps entièrement automatisé. La quantification de la figure 2 est obtenu comme illustré sur la figure 1, où l&#39;analyse automatisée segmentation produit autour des saillies pénétrant dans la cellule de la BMM U-87 MG corps sphéroïde. A noter que pour cette lignée cellulaire, le corps de sphéroïde de tumeur est exclu de la mesure de la zone envahie. Un modèle différent de invasion est affichée par des lignes squameuses humaines de cellules cancéreuses de la tête et du cou. CAL S et R sont CAL isogène, mais CAL S est sensible à, et CAL R résistants aux inhibiteurs de la tyrosine kinase EGFR 14. En l&#39;absence d&#39;EGF, ni lignée cellulaire a envahi dans la BMM (Figure 3) Toutefois, comme la concentration de EGF a été augmentée (à 2,5 ng / ml), les sphéroïdes semblent «bud». Aux concentrations plus élevées de l&#39;EGF (40 et 80 ng / ml) le degré d&#39;invasion a été réduite. Ceci est cohérent avec la réponse à la dose classique en forme de cloche à l&#39;EGF en termes d&#39;invasion qui a été précédemment rapporté 15. Dans 20 ng / ml d&#39;EGF, saillies en forme de doigts extrudées à partir du corps principal de sphéroïdes CAL R tandis que les cellules CAL S étaient moins invasive après 72 h (Figure 3). Cette invasion différentielle était évidente 48 heures après sphéroïdes ont été placés dans BMM (contenant 20 ng / ml d&#39;EGF de distinction maximal entre des lignes de cellules) Et le plus grand après 72 h (Figure 4). Ces images ont été acquises rapidement à l&#39;aide d&#39;un cytomètre imagerie, comme pour U-87 MG. Cependant, dans ce cas, pour illustrer un autre procédé, le degré d&#39;invasion a été quantifiée manuellement en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image autonome et est présentée sous forme graphique (figures 3 et 4). Ces résultats illustrent une différence phénotypique entre les cellules sensibles aux médicaments et résistantes qui pourraient être utilisés pour cribler des composés qui antagonisent spécifiquement le médicament résistant, phénotype invasif. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig1.jpg" /> Figure 1. Aperçu schématique de la 3D sphéroïde tumeur dosage d&#39;invasion. Le flux de travail montre les étapes de la méthode consiste à inclure des images représentatives de sphéroïdes U-87 MG glioblastome juste après incorporation dans BMM (panneau supérieur; t = 0) et après l&#39;invasion<html> dans BMM (panneau de fond; t = 72 h) avec et sans la segmentation qui mesure la zone couverte par les cellules envahissantes. Bar = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig2.jpg" /> Figure 2. Le cours du temps invasion U-87 MG glioblastome sphéroïde dans BMM. U-87 MG sphéroïde invasion 3D dans BMM a été surveillée et quantifiée jusqu&#39;à 72 heures en utilisant un cytomètre imagerie. (A) Des images représentatives et (B) la quantification des invasion des cellules tumorales sont indiquées. Bar = 500 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> re 3 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg &quot;/&gt; Figure 3. CAL R (résistant) et CAL S (sensible) invasion sphéroïde de la tumeur. (A) Des images représentatives et (B) la quantification manuel de l&#39;EGF dose-dépendante CAL R et S CAL sphéroïde invasion tumorale sont présentés. Bar = 500 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig4.jpg" /> Figure 4. Les cellules de CAL R (résistants) sphéroïdes sont plus invasive que S sphéroïdes tumoraux CAL (sensibles) lorsqu&#39;il est placé dans BMM. Sur sphéroïdes tumorales EGF stimulation CAL R montrent une invasion plus prononcée que CAL S. (A) Des images représentatives et (B) la quantification manuel d&#39;invasion sont représentés. Bar = 500 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

three-dimensional-3d-tumor-spheroid-invasion-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

56.5K vues.  The Institute of Cancer Research. Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Vidéo: Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

Spheroid Assay to Measure TGF-&amp;#946;-induced Invasion

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Assay Sphéroïde pour mesurer le TGF-β induit Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Recherche

Médecine

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

L&#39;homme neuroendocriniennes lignées cellulaires tumorales comme un modèle tridimensionnel pour l&#39;étude de la thérapie des tumeurs neuro-endocrines humaines

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in particular the role of the resident (stromal) cells. Studies in primary carcinomas demonstrate the influence of the microenvironment on metastasis, even on prognosis1,2. Especially the tumor associated macrophages (TAM) support migration, invasion and proliferation3. Interestingly, the major target sites of metastasis possess tissue-specific macrophages, such as Kupffer cells in the liver or microglia in the CNS. Moreover, the metastatic sites also possess other tissue-specific cells, like astrocytes. Recently, astrocytes were demonstrated to foster proliferation and persistence of cancer cells4,5. Therefore, functions of these tissue-specific cell types seem to be very important in the process of brain metastasis6,7.
Despite these observations, however, up to now there is no suitable in vivo/in vitro model available to directly visualize glial reactions during cerebral metastasis formation, in particular by bright field microscopy. Recent in vivo live imaging of carcinoma cells demonstrated their cerebral colonization behavior8. However, this method is very laborious, costly and technically complex. In addition, these kinds of animal experiments are restricted to small series and come with a substantial stress for the animals (by implantation of the glass plate, injection of tumor cells, repetitive anaesthesia and long-term fixation). Furthermore, in vivo imaging is thus far limited to the visualization of the carcinoma cells, whereas interactions with resident cells have not yet been illustrated. Finally, investigations of human carcinoma cells within immunocompetent animals are impossible8.
For these reasons, we established a coculture system consisting of an organotypic mouse brain slice and epithelial cells embedded in matrigel (3D cell sphere). The 3D carcinoma cell spheres were placed directly next to the brain slice edge in order to investigate the invasion of the neighboring brain tissue. This enables us to visualize morphological changes and interactions between the glial cells and carcinoma cells by fluorescence and even by bright field microscopy. After the coculture experiment, the brain tissue or the 3D cell spheroids can be collected and used for further molecular analyses (e.g. qRT-PCR, IHC, or immunoblot) as well as for investigations by confocal microscopy. This method can be applied to monitor the events within a living brain tissue for days without deleterious effects to the brain slices. The model also allows selective suppression and replacement of resident cells by cells from a donor tissue to determine the distinct impact of a given genotype. Finally, the coculture model is a practicable alternative to in vivo approaches when testing targeted pharmacological manipulations.

The organotypic brain slice coculture with carcinoma cells enables visualizing morphological changes by fluorescence as well as bright field (video) microscopy during the process of carcinoma cell invasion of brain tissue. This model system also allows for cell exchange and replenishment approaches and offers a wide variety of manipulations and analyses.

Système de co-culture avec un cerveau organotypique et 3D sphéroïde de cellules de carcinome

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Quantification du cancer du sein cellulaire envahissement aide d&#39;un (3D) du modèle en trois dimensions

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Évaluation de Cancer de l&#39;ovaire Spheroid attachement et l&#39;invasion des cellules mésothéliales en temps réel

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

En trois dimensions modèle de co-culture tumeur stromale-Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

Une cellule cancéreuse Spheroid test pour évaluer Invasion dans un Cadre 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Tridimensionnelle Alginate-perle culture de cellules humaines adénome hypophysaire

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Three-Dimensional Culture Assay pour explorer des cellules cancéreuses invasives et Tumor Satellite Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Three-Dimensional Printing of a Complex Aortic Anomaly

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal symptoms. These anomalies may be associated with other congenital heart diseases. It is hard to identify the accurate anatomic vessel location from two-dimensional imaging data, such as computed tomography. As an additive manufacturing method, three-dimensional (3-D) printing can covert the acquired imaging data into 3-D physical models. This protocol describes the procedure for modeling the volumetric DICOM imaging into 3-D data and printing it as an anatomically realistic 3-D model. Using this model, surgeons can identify the vessel location of complex aortic anomalies, which is helpful for pre-operative planning and intra-operative guidance.

Here, we present a protocol to use three dimensional printed models for pre-operative planning and intra-operative reorganization of complicated vascular locations when handling a congenital aortic anomaly.

Impression en trois dimensions d’une anomalie aortique complexe

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal ...