Modification du génome compose de techniques avec laquelle les chercheurs peuvent « edit » ou modifier une séquence spécifique d’ADN. Ces méthodes reposent sur la création de petits « morceaux » dans l’ADN, dont les cellules tentent de réparer, souvent de manière incomplète. De cette manière, les scientifiques peuvent provoquer des mutations dans séquences ciblées avec une plus grande efficacité par rapport au ciblage génétique classique.

Dans cette vidéo, nous examiner les principes qui sous-tendent les trois techniques d’édition du génome et nous discuterons un protocole généralisé pour l’un d'entre eux, le système CRISPR-Cas9. Nous allons ensuite explorer certaines applications de ces méthodes.

Tout d’abord, penchons-nous sur les principes qui sous-tendent la modification du génome.

La méthode classique pour l’introduction de modifications génétiques à des séquences spécifiques dans le génome est gène par recombinaison homologue, d'où l’incorporation de séquences homologues dans la construction de ciblage mène à la commutation « out » du gène endogène pour une version modifiée.

Comme le ciblage génétique, génome édition peut cibler les changements à des régions spécifiques de l’ADN, mais elle peut le faire avec une efficacité beaucoup plus élevée, instituant les mutations souhaitées dans plusieurs cellules dans une expérience donnée.

Toutes les méthodes de modification du génome s’appuient sur la capacité d’une cellule à la réparation des cassures double brin mis son ADN par endonucléases. Ces dommages peuvent être réparés par rejoindre non-homologues fin ou NHEJ, où les extrémités de l’ADN brisées sont refermées directement ; ou de réparation axés sur l’homologie ou HDR, où le dommage est fixé en le copiant à partir d’un modèle homologue. NHEJ n’est pas habituellement parfait et pourrait entraîner plusieurs bases étant supprimé ou ajouté à l’ADN réparé, donc mutation de la séquence cible. En revanche, HDR permet aux chercheurs ajouter un modèle d’ordonner des modifications spécifiques au site cible.

Trois techniques d’édition génome majeurs ont été développés et popularisés au cours des dernières années.

Dans une seule méthode, domaines de chercheurs fusible liant à l’ADN « doigt de zinc » de certaine transcription factors vers le domaine ADN-clivage de la Fokj’ai endonucléase. Comme chaque domaine de doigt de zinc reconnaît un triplet de nucléotides spécifiques, ces domaines peuvent être artificiellement liés ensemble à ingénieur zinc finger nucleases ou ZFNs, qui ciblent des séquences d’ADN uniques.

De même, nucléases, appelés « TALENs » join Fokj’ai vers les domaines de liaison à l’ADN variables de protéines bactériennes appelé effecteurs comme activateur de transcription, ou contes. Chaque domaine conte reconnaît une seule base ADN unique, donnant TALENs leur spécificité de séquence.

Enfin, le système CRISPR-Cas9 utilise les composants d’un système immunitaire procaryote qui normalement protège son hôte contre l’incursion de matériel génétique étranger, comme ceux de virus ou de plasmides. Dans ce système, morceaux d’envahir les ADN étranger appelé « protospacers » sont incorporés dans un locus CRISPR, qui est ensuite transcrit et traité par des machines de protéine-ARN en petits ARN appelé crRNAs.

Les scientifiques sont exploiter les machines CRISPR fins génomique de l’édition en concevant des séquences crRNA-comme guide, connus comme « guide unique » ou sgRNA, qui peut être utilisé pour cibler Cas9 à presque n’importe quelle séquence génétique désirée dans les cellules de mammifères ou d’autres systèmes d’intérêt. Les possibilités de personnalisation simple du RNA sequence-CRISPR-Cas9 système fournissent des avantages distincts sur la base de protéines du génome, édition de méthodes telles que ZFNs et TALENs.

Maintenant que vous avez appris sur les principes qui sous-tendent la modification du génome, passons en revue un protocole typique d’utilisation CRISPR pour créer des changements génétiques ciblés dans les cellules de mammifères.

Tout d’abord, est choisi un emplacement génomique d’être édité. Cette région doit être courte — environ 20 paires de bases en taille — et possèdent un 3-régions depuis longtemps « motif adjacent du protospacer » ou « PAM » à son extrémité 3′. La PAM est nécessaire pour Cas9 à reconnaître et à s’attacher à la région de l’ADN cible, et la séquence exacte est spécifique à l’organisme d’origine de la Cas9 utilisé. Une fois qu’un site potentiel a été identifié, il doit être recherché contre la séquence du génome pour garantir que les sites similaires sont introuvables ailleurs dans le génome, et donc aucune régions génomiques hors cible ne seront éditées.

Pour synthétiser la séquence de guide CRISPR, deux oligonucléotides sont générés, un identique et un complémentaire de la séquence cible. Des séquences supplémentaires figurent sur leurs extrémités 5′ pour assurer la compatibilité avec les vecteurs de la sgRNA. Ces oligonucléotides sont ensuite mélangés, dénaturés et puis recuits.

Ensuite, un plasmide contenant un sgRNA « échafaudage » est coupé avec l’enzyme de restriction appropriée, mélangé avec la séquence de guide CRISPR synthétisée et incubées en présence de l’enzyme de ligase à créer la construction sgRNA. Le plasmide peut ensuite être transformé en bactéries et cultivé pour l’amplification. Une fois purifié de bactéries, la construction CRISPR est co-transfectée avec une construction encodage Cas9 dans les cellules dont le génome doit être modifié. Ces cellules transfectées sont cultivées pour former des colonies de clones.

L’ADN génomique peut être isolé de chaque colonie et analysé par PCR ou séquençage à l’écran pour ceux dans lesquels le système CRISPR a produit les mutations souhaitées.

Penchons-nous maintenant sur quelques moyens scientifiques utilisent les techniques d’édition de génome.

De nombreux chercheurs utilisent génome édition pour introduire des séquences de reporter à des loci spécifiques. Dans cette expérience, ZFNs ont été utilisés pour insérer la protéine fluorescente verte dans un gène impliqué dans la survie et le développement des neurones. Chercheurs ont confirmé qu’ils correctement ciblé ce gène en enjoignant à se différencier en neurones, les cellules souches et en effectuant des double immunofluorescence GFP et marqueurs neurones.

Modification du génome aussi rend beaucoup plus facile de générer des organismes « knockout » dans lequel un gène d’intérêt est rendu non fonctionnelle. Ici, les chercheurs ont tenté de créer des souris déficientes en injectant des embryons avec l’ARNm codant pour les TALENs qui ciblent des gènes spécifiques. Traitement ultérieur de l’endonucléase de l’ADN de souris traitées TALEN a permis aux chercheurs d’identifier les animaux présentant des mutations dans les deux copies du gène ciblé.

Enfin, génome édition peut servir à créer de grandes destructions génétiques en provoquant des cassures double brin deux dans la même région chromosomique. Ces délétions importantes peuvent être nécessaires lorsque la fonction d’un gène ou d’élément génétique ne peut pas être assommée par les suppressions de petites créées avec génome conventionnel retouche des protocoles. Ici, les chercheurs co-électroporation souris les cellules cancéreuses avec un GFP construire et CRISPR deux constructions ciblant différents domaines au sein d’un gène du cancer au volant. Les cellules qui ont été transfectées avec succès, et qui seraient donc émettre de signal GFP, ont été isolés par fluorescence-lancée de cellules tri et PCR ultérieur et les cellules de séquençage identifié dans lequel la région de l’ADN entre les deux sites ciblés CRISPR a été supprimée.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur la modification du génome. Ici, nous avons passé en revue les principes derrière ZFNs, TALENs, et CRISPR, exploré un protocole général de CRISPR-Cas9 et a examiné comment les chercheurs utilisent du génome des techniques d’édition aujourd'hui. Comme toujours, Merci pour regarder !