Genom-Bearbeitung umfasst Techniken mit denen Forscher "Bearbeiten" oder eine spezifische DNA-Sequenz ändern können. Diese Methoden beruhen auf die Schaffung von kleinen "cuts" in der DNA, die Zellen versuchen zu reparieren, oft unvollständig. Auf diese Weise können Wissenschaftler Mutationen in gezielte Sequenzen mit größerer Effizienz im Vergleich zu klassischen Gen gezielt auslösen.
In diesem Video werden wir überprüfen die Prinzipien hinter drei Genom Schnitttechniken und diskutieren ein allgemeines Protokoll für eines davon, das CRISPR-Cas9-System. Wir werden dann einige Anwendungen dieser Methoden erforschen.
Zuerst schauen wir uns die Prinzipien hinter Genom-Bearbeitung.
Die klassische Methode für die Einführung von genetischer Veränderungen auf bestimmte Sequenzen im Genom ist Gene targeting-durch homologe Rekombination, wo führt die Einbeziehung der homologen Sequenzen in das targeting Konstrukt zu "switching," des endogenen Gens für eine geänderte Version.
Wie Gene targeting, Genom-Bearbeitung kann gezielt Änderungen an spezifische DNA-Abschnitte, aber er kann dafür mit einem viel höheren Wirkungsgrad, Festlegung der gewünschten Mutationen in mehr Zellen in jedem gegebenen Experiment.
Alle Genom Bearbeitungsmethoden verlassen sich auf die Fähigkeit einer Zelle, Doppel-Strangbrüchen gemachten jedoch an seiner DNA zu reparieren. Diese Schäden kann repariert werden, indem nonhomologous Ende beitreten oder NHEJ, wo defekte DNA enden direkt wieder verschlossen werden; unter der Regie von Homologie Reparatur oder HDR, wo der Schaden ist durch Kopieren aus einer homologen Vorlage fest. NHEJ ist nicht in der Regel perfekt und kann dazu führen, dass mehrere Basen, gelöscht oder hinzugefügt, um die reparierte DNA, damit mutiert die Zielsequenz. Auf der anderen Seite kann HDR Forscher in einer Vorlage zu spezifischen Änderungen an den Zielstandort direkt hinzufügen.
Drei große Genom Schnitttechniken wurden entwickelt und in den letzten Jahren populär.
In einer Methode Forscher Sicherung DNA-Bindung "Zinkfinger" Domänen bestimmte Transkription Faktoren auf den DNA-Spaltung der Fokich Endonuklease. Da jede Zink-Finger-Domäne eine spezifische Nukleotid-Triplett erkennt, können diese Domains künstlich miteinander verbunden werden, Ingenieur-Zink-Finger-Nukleasen oder ZFN, die auf einzigartige DNA-Sequenzen.
In ähnlicher Weise rief ich den Variablen DNA-bindende Domänen bakterielle Proteine Nukleasen genannt "TALENs" Join FokTranskription Aktivator-ähnlichen Effektoren oder Geschichten. Jede Erzählung Domäne erkennt eine einzige, einzigartigen DNA-Basis, TALENs ihrer Sequenz Besonderheit geben.
Schließlich verwendet das CRISPR-Cas9 System Komponenten eines prokaryotische Immunsystems, die normalerweise seinen Wirt gegen Eindringen von fremden genetischen Materials, wie Viren oder Plasmide schützt. In diesem System fließen Stücke einer Invasion fremden DNA genannt "Protospacers" in einem CRISPR-Locus, die dann transkribiert und von Protein-RNA-Maschinen in kleinen RNAs genannt CrRNAs verarbeitet.
Wissenschaftler sind Nutzbarmachung der CRISPR-Maschinen für die genomische Bearbeitung durch die Gestaltung der CrRNA-wie Führer Sequenzen bekannt als "einzigen Leitfaden" oder SgRNA, die verwendet werden kann Cas9 an fast jede gewünschte Gensequenz in Säugerzellen oder anderen Systemen von Interesse. Die einfache Anpassbarkeit des RNA-Sequenz-basierte CRISPR-Cas9 Systems bietet deutliche Vorteile gegenüber Protein-basierten Genom Bearbeitungsmethoden wie ZFN und TALENs.
Nun, da Sie über die Grundsätze der Genom-Bearbeitung gelernt haben, betrachten wir ein typisches Protokoll CRISPR zu verwenden, um gezielte genetische Veränderungen in Säugetierzellen zu erstellen.
Zunächst wird eine genomische Position bearbeitet werden gewählt. Dieser Region muss kurz sein – ca. 20 Basenpaaren in der Größe – und verfügen über eine 3-Länge lang "Protospacer angrenzenden Motiv" oder "PAM" an seinem 3 '-Ende. PAM ist erforderlich für Cas9 zu erkennen und die Ziel-DNA-Region zu Spalten, und die genaue Reihenfolge ist spezifisch für den Organismus-of-Origin für die Cas9 verwendet wird. Sobald eine potenzielle Website identifiziert wurde, sollte es durchsucht werden, gegen die Genomsequenz, damit ähnliche Websites findet man nicht an anderer Stelle im Genom, und somit keine Ziel-genomischen Regionen bearbeitet werden.
Um die CRISPR-Führer-Sequenz zu synthetisieren, zwei Oligonukleotide werden generiert, eine identische und eine Ergänzung zu der Zielsequenz. Zusätzliche Sequenzen sind auf ihren 5′ Enden für die Kompatibilität mit den SgRNA Vektoren enthalten. Diese Oligonukleotide werden dann miteinander vermischt, denaturiert und anschließend geglüht.
Als nächstes ist ein Plasmid enthält eine SgRNA "Gerüst" mit den entsprechenden Restriktionsenzym geschnitten, gemischt mit der synthetisierten CRISPR-Reiseführer-Sequenz und inkubiert mit Ligase-Enzym, das SgRNA-Konstrukt zu schaffen. Das Plasmid kann dann in Bakterien umgewandelt und für Verstärkung kultiviert. Sobald von Bakterien gereinigt, ist das CRISPR-Konstrukt Co transfizierten mit ein Konstrukt Codierung Cas9 in die Zellen, deren Genom bearbeitet werden soll. Diese transfizierten Zellen werden kultiviert, um klonalen Kolonien bilden.
Genomischer DNA isoliert von jeder Kolonie und durch PCR und Sequenzierung analysiert werden kann zum Bildschirm für diejenigen, in denen das CRISPR-System hat die gewünschte Mutationen produziert.
Jetzt schauen wir uns an einigen weisen Wissenschaftler Genom Bearbeitung Techniken verwenden.
Viele Forscher verwenden Genom Bearbeitung um Reporter Sequenzen in bestimmten Loci einzuführen. In diesem Experiment wurden ZFN zur grünes fluoreszierendes Protein in ein Gen eingefügt, das Neuron Entwicklung und überleben beteiligt ist. Forscher bestätigt, dass sie korrekt dieses Gens ausgerichtet durch Stammzellen in Neuronen zu unterscheiden, und doppelte Immunfluoreszenz für GLP und neuronale Marker durchführen.
Genom-Bearbeitung hat es auch viel einfacher zu "Knockout" Organismen zu erzeugen, in denen ein Gen des Interesses nichtfunktionale gerendert wird. Forscher wollten hier, Knockout-Mäusen durch die Injektion von Embryonen mit mRNA TALENs, die auf spezifische Genen Codierung zu erstellen. Nachfolgende Endonuklease Behandlung von DNA aus TALEN-behandelten Mäusen konnten die Forscher um Tiere mit Mutationen in beiden Kopien des Gens gezielt zu identifizieren.
Zu guter Letzt kann Genom-Bearbeitung verwendet werden, zu großen genetischen Deletionen erstellen, indem Sie zwei Doppel-Strangbrüche in der chromosomalen Region verursacht. Diese große Deletionen können erforderlich sein, wenn die Funktion eines Gens oder genetisches Element kann nicht durch die kleine Deletionen mit konventionellen Genom Bearbeitung Protokolle erstellt ausgeschlagen werden. Hier Forscher co-elektroporiert Maus Krebszellen mit einer GFP zu konstruieren und zwei CRISPR baut gezielt verschiedene Bereiche innerhalb eines Gens Krebs fahren. Zellen, die erfolgreich transfiziert wurden, die somit GFP Signal aussenden würde, wurden isoliert von Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren, und anschließende PCR und Sequenzierung identifiziert Zellen, in denen die DNA-Region zwischen den beiden Standorten CRISPR-gezielt gelöscht wurde.
Sie haben nur Jupiters Video auf Genom-Bearbeitung angesehen. Hier haben wir die Prinzipien hinter ZFN, TALENs, überprüft und CRISPR, eine allgemeine CRISPR-Cas9 Protokoll erforscht und diskutiert, wie Forscher Genom Bearbeitung Techniken heute verwenden. Wie immer vielen Dank für das ansehen!
