Nous souhaitons remercier Johnson &amp; Johnson, la TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X et Trius Therapeutics pour fournir bedaquiline, PA-824 (prétomanide), AZD5847, radezolid et tedizolid, respectivement. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li et Danielle Weiner ont soutenu l&#39;analyse MALDI, les méthodes bioanalytiques, la préparation du substitut de la casum, la synthèse chimique et l&#39;isolement de la casée de lapin. Ce travail a été mené avec le financement de la Fondation Bill et Melinda Gates, le prix # OPP1044966 et OPP1024050 à V. Dartois, Subvention d&#39;instrumentation partagée NIH S10OD018072, ainsi que le financement conjoint de la Fondation Bill et Melinda Gates et Wellcome Trust pour un Centre d&#39;excellence Pour l&#39;optimisation du plomb pour les maladies du monde en développement à P. Wyatt.

Toutes les études sur les animaux ont été effectuées conformément au Guide pour la prise en charge et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire des Instituts nationaux de santé avec l&#39;approbation du Comité de soins et de soins pour animaux institutionnels du NIAID (NIH), Bethesda, MD. Toutes les études impliquant M. tuberculosis ont été effectuées dans un laboratoire avec un niveau de confinement de biosécurité 3 (BSL-3). 1. Modèle d&#39;infection de lapin et collection Caseum <ol><li> Infecte les lapins blancs de Nouvelle-Zélande avec M. tuberculosis en utilisant un système d&#39;exposition aux aérosols sans nez comme décrit précédemment. 12 , 13 Permettre à l&#39;infection de progresser pendant 12 à 16 semaines. Saisissez les lapins avec 35 mg / kg de kétamine et 5 mg / kg de xylazine par voie intramusculaire, euthanasiez les lapins avec 0,22 ml / kg de pentobarbital de sodium et de phénytoïne sodique par voie intraveineuse et poursuivez les nécropsies. </li><li> À l&#39;aide de pincettes et d&#39;un scalpel, retirez les poumons du coffre caVité. De chaque lobe pulmonaire, disséquer les cavités individuelles et les grands granulomes nécrotiques à l&#39;aide d&#39;un scalpel. Rassurer soigneusement le caséum des parois de la cavité et du granulome. Peser, enregistrer et stocker les échantillons dans des tubes à vis de 2 mL à -20 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient prêts à l&#39;emploi. </li><li> Rayons gamma des échantillons infectieux de caséum à 3 MegaRad sur de la glace carbonique pour les rendre inutilisables et sans danger pour l&#39;utilisation dans un laboratoire BSL-2. </li></ol> 2. Génération in vitro de la substitution de casée à partir de cellules THP-1 <ol><li> Cultiver des monocytes THP-1 dans du milieu RPMI 1640 (L-glutamine 2 mM et 10% de sérum bovin fœtal) dans des flacons de culture cellulaire T175 (80 ml / flacon). Incuber les flacons dans une atmosphère de CO2 à 5% à 37 ° C pendant 3 à 4 jours. </li><li> Centrifuger la culture d&#39;un flacon T175 dans deux tubes coniques de 50 ml à 150 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant et suspendre la pastille dans 10 mL de média RPMI 1640. </li><li> Pipetter 5 μL de cette culture dans un tube de 1,5 mL contenant 45 μL de tRypan bleu. Bien mélanger en pipettant. Transférer 10 μL à un hémocytomètre et compter le nombre de monocytes THP-1 viables (non colorés) à l&#39;aide d&#39;un microscope optique (grossissement 10X). Calculer le nombre de cellules viables par ml de la culture. Diluez-le avec du milieu RPMI jusqu&#39;à la densité finale de 1,25 x 10 6 cellules / mL. </li><li> Chargez 40 mL de la culture sur une grande plaque de culture cellulaire (50 x 10 6 cellules / plaque). Ajouter 40 μL de PMA 100 μM (acétate de 12-myristate-13 de phorbol préparé dans l&#39;éthanol) et permettre aux cellules d&#39;adhérer pendant la nuit dans l&#39;incubateur. NOTE: La concentration finale de PMA est de 100 nM. </li><li> Diluer l&#39;acide oléique pur (OA) (0,89 g / mL) dans de l&#39;éthanol à la concentration de 0,1 M ( c&#39;est-à-dire 31,7 μL d&#39;OA dans 968,3 μl d&#39;éthanol). Diluer cette solution dans des milieux RMPI préchauffés frais à une concentration de 10 mM. Diluer cette suspension OA à 0,4 mM (concentration finale de travail) en milieu RPMI préchauffé à 37 ° C. </li><li> Supprimez les médias existants et non-adhered cellules provenant des plaques de culture de cellules et ajouter doucement 40 ml de 0,4 mM OA pour les macrophages THP-1 (THP-M). Incuber à 37 ° C dans l&#39;incubateur pendant une nuit. </li><li> Utilisez un microscope optique à un grossissement de 40x pour confirmer visuellement la présence de nombreuses inclusions de corps lipidiques dans chaque THP-M. Retirer tout le milieu RPMI à partir des plaques de culture de cellules et laver délicatement les cellules adhérentes deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en utilisant une pipette sérologique de 50 ml. REMARQUE: les corps Lipid apparaissent sous la forme de petites structures claires, sphériques dans le cytoplasme de la THP-M. </li><li> Ajouter 40 ml de 5 mM d&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans du PBS à chaque plaque. Incuber pendant 15 min à 37 ° C. </li><li> Détacher les macrophages spumeux (FM) en pipetant à plusieurs reprises de haut en bas sur la surface de toute la plaque en utilisant une pipette sérologique de 10 ml. Transférer la suspension cellulaire à un tube conique de 50 ml et centrifuger à 150 g pendant 5 min. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de PBS (troisième lavage PBS) unEt transfert à un tube conique pré-pesé de 15 ml. Retournez à 150 xg pendant 5 min. Aspirer soigneusement le surnageant à l&#39;aide d&#39;une pipette sérologique et jeter. </li><li> Suivez les pastilles de FM à 3 cycles de congélation-décongélation pour lyser les cellules et les incuber à 75 ° C pendant 20-30 minutes pour dénaturer les protéines dans la matrice. Conservez les granulés à -20 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient prêts à l&#39;emploi. </li></ol> 3. Essai de dialyse à équilibrage rapide (ROUGE) <ol><li> Préparer des solutions stock 10 mM de tous les composés d&#39;essai dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Diluer à 500 μM de solutions de travail dans le DMSO avant chaque dosage. </li><li> Pesez le tube contenant la pastille de substitution Caseum. Soustraire le poids du tube vide pour obtenir le poids de la pastille seule. Ajouter 2-3 grains de métal par tube et, en utilisant un homogénéisateur de tissu à 1200 coups / min pendant 1 min, perturber le caséum ou la matrice de substitution dans le PBS (1: 9 w / v) pour obtenir une suspension 10x diluée de chaque matrice. </li><li> Spike 6,5 μL des 500uM solution du composé d&#39;essai dans 643,5 ul de l&#39;homogénat pour obtenir la concentration finale de 5 uM (≤1% de DMSO) et vortex. </li><li> Placez les inserts rouges dans la plaque de base. Ajouter 200 ul de la matrice de médicament-dopés dans la chambre de donneur (anneau rouge) de chaque insert RED et 350 ul de PBS dans chaque chambre de récepteur. Préparer 3 inserts pour chaque composé d&#39;essai (échantillons en triple). plaque d&#39;étanchéité avec un joint d&#39;étanchéité de plaque adhésif et incuber à 37 ° C sur le Thermomixer à 200 tours par minute (1 xg) pendant 4 h. </li><li> Après l&#39;incubation, mélanger doucement le contenu des chambres de donneur et receveur par pipetage vers le haut et vers le bas 2-3 fois. Pipeter 20 uL à des aliquotes d&#39;homogénat à partir des chambres de donneur et ajouter à 20 pl de PBS pur dans un tube de 1,5 ml (1: 1). De même, à partir des chambres de réception et ajouter à 20 pl d&#39;homogénat propre (adaptation de la matrice) sur la pipette des aliquotes de 20 pi d&#39;échantillons de PBS. 8 REMARQUE: la matrice de correspondance élimine le neced 2 courbes d&#39;étalonnage séparées (dans l&#39;homogénat et PBS) à effectuer une analyse quantitative. Contenu de la chambre de donneur peuvent sédimenter au cours du temps. Mélanger délicatement le contenu par pipetage avant de retirer aliquotes. </li></ol> 4. LC-MS Quantification et analyse des données <ol><li> Ajouter 160 ul de 1: 1 methanol: acétonitrile contenant 500 ng / mL de diclofénac ou 10 ng / mL verapamil (étalon interne) à chaque tube et vortexer pour précipiter les protéines. Centrifuger à 10 000 xg pendant 5 minutes pour sédimenter le précipité et on surnageants transfert en plaques de 96 puits à puits profonds pour l&#39;analyse de Chromatographie spectrométrie de masse liquide (LCMS). 7 </li><li> Construire des courbes d&#39;étalonnage à partir de 1-1,000 nM pour chaque composé d&#39;essai tout en maintenant la même composition de matrice que les échantillons ci-dessus. Quantifier la concentration du composé d&#39;essai dans les échantillons provenant des chambres de donneur et receveur au moyen d&#39;un procédé LC-MS. </li><li> Calculer la fraction non liée (f u) oF le médicament dans la matrice diluée en utilisant l&#39;équation 1. Calculer le f u dans la matrice non diluée en utilisant l&#39;équation 2 ( D = facteur de dilution de 10). 14 <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" /> <img alt="L&#39;équation 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" /></li><li> Vérifier la récupération (masse) de chaque composé en utilisant l&#39;équation 3 pour identifier les composés avec des problèmes de stabilité / métabolisme / liaison non spécifique. NOTE: Le recouvrement tombe généralement entre 70% et 130%. 15 <img alt="L&#39;équation 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" /></li></ol>

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	<li>Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+versus+bugs:+in+pursuit+of+the+persistent+predator+Mycobacterium+tuberculosis.">Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+dormant+tubercle+bacilli+and+latent+tuberculosis.">Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis.</a> Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).</li><li>Aber, V. R., Nunn, A. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculous+Granulomas+are+Hypoxic+in+Guinea+pigs,+Rabbits,+and+Non-Human+Primates.">Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates.</a> Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).</li><li>Kalvass, J. C., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+nonspecific+brain+and+plasma+binding+on+CNS+exposure:+implications+for+rational+drug+discovery.">Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery.</a> Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).</li><li>Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. 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Il n&#39;y a pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

Les lésions et les cavités nécrotiques pulmonaires chez les patients infectés par la tuberculose contiennent des sous-populations de bactéries qui sont récalcitrantes au traitement médicamenteux. Les carottes caséoises de ces structures sont particulièrement responsables d&#39;abriter ces persisters dans un environnement extracellulaire. 16 La répartition favorable des agents anti-bactériens dans ces endroits éloignés est considérée comme un déterminant important de l&#39;efficaci...

Le traitement de la maladie de la tuberculose pulmonaire exige une distribution efficace des médicaments dans différents types de lésions. des lésions nécrotiques et les cavités contiennent des centres caséeux qui abritent des sous-populations de bactéries tolérantes à la drogue ou « persistant ». 1, 2 La maladie cavitaire est associée à des taux de guérison inférieurs et un mauvais pronostic. 3, 4 études antérieures ont montré, en utilisant des techniques quantitatives et d&#39; imagerie, que la capacité de pénétrer caseum varie considérablement d&#39;une classe de médicaments à l&#39; autre. 5, 6 Ces méthodes nécessitent cependant l&#39;utilisation de modèles d&#39;infection des animaux qui sont lents et fastidieux. Un dosage in vitro qui mesure la liaison au médicament ex vivo caseum a été conçu. Cette liaison a été trouvé en corrélation inverse avec la pénétration des médicaments dans les granulomes caséeux et, par conséquent, estutilisé comme un outil de prédiction. 7 dialyse d&#39;équilibre est considéré comme l&#39;approche standard de l&#39;or à des études de liaison aux protéines plasmatiques. Le dispositif de dialyse d&#39;équilibre rapide (RED) offre un moyen rapide, facile à utiliser et système fiable pour effectuer ces tests. 8 Le dispositif est constitué de deux composants: à usage unique, jetable , comprenant des inserts 2 chambres séparées par un cylindre vertical de la membrane semi-perméable; et les plaques de base réutilisable qui peut contenir jusqu&#39;à 48 inserts à la fois. La membrane de dialyse a un qui est idéal pour des études de liaison à la drogue macromolécule de coupure 8 kDa de poids moléculaire (MWCO). Le rapport des volumes zone superficielle élevée du compartiment de membrane permet une dialyse rapide et équilibration. Les deux inserts et la plaque de base ont été validés pour une liaison non spécifique minimale. La combinaison du dispositif RED avec des techniques bioanalytiques fournit des estimations précises des fractions non liées de médicaments en pLasma. 8, 9 Bien que conçu à l&#39;origine pour mesurer liaison aux protéines plasmatiques, le dispositif RED a été utilisé dans plusieurs études de liaison de tissus en utilisant broyats. 10, 11 Dans ce protocole, on mesure la drogue se liant à caseum, les débris nécrotiques excisée des lésions nécrotiques et des cavités de lapins infectés par la tuberculose. Le acellulaire et la nature non-vasculaire caséeuse le rend facile à homogénéise en une suspension homogène qui est compatible avec le dosage. Étant donné que caseum est fastidieux à produire et difficiles à trouver, le protocole a été validé pour une utilisation avec une matrice de substitution qui est préparé à partir de macrophages spumeux. macrophages dérivés de monocytes THP-1 sont induits par l&#39;acide oléique pour accumuler plusieurs corps lipidiques qui leur donnent leur aspect « mousseuse ». Ces cellules chargées de lipides sont récoltées etTraité pour produire une matrice que nous utilisons comme substitut au caséum. Cette étude a montré que la liaison du médicament à cette matrice de substitution est bien corrélée à la liaison avec le caséum, imitant efficacement le processus in vivo qui entrave la pénétration du médicament dans le noyau caséo de granulomes et de cavités.

<table><tbody><tr><td>New Zealand White Rabbits</td><td>Covance</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution&amp;nbsp;</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 monocytic cell line</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>175 cm&amp;sup2; TC-Treated Flask (T175)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-3400-175</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 media w/o glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091003IR</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone L-glutamine, 200 mM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-2881-1</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15178101</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Device Reusable Base Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89811</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Device Inserts, 50/box&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89809</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED insert removal tool&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>89812</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive plate seal</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Diclofenac sodium salt</td><td>Sigma</td><td>93484</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>2010 Geno/Grinder</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-158</td><td></td></tr><tr><td>484R Cobalt 60 Irradiator</td><td>JL Shepard</td><td>7810-484-1</td><td></td></tr><tr><td>INCYTO&amp;nbsp;C-Chip Disposable Hemacytometers</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td></td></tr><tr><td>Upright Light Microscope</td><td>Leica</td><td>DM1000</td><td></td></tr><tr><td>Binary Liquid Chromatography system</td><td>Agilent</td><td>1260</td><td>Multi-compenent</td></tr><tr><td>Mass spectrometer</td><td>AB Sciex</td><td>4000</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro caseum binding assay that predicts drug penetration in tuberculosis lesions

L&#39;éradication de la maladie de la tuberculose nécessite des schémas thérapeutiques qui peuvent pénétrer dans les couches multiples de lésions pulmonaires complexes. La distribution des médicaments dans les noyaux caséeuses des cavités et des lésions est particulièrement crucial car ils abritent des bactéries sous-populations tolérantes médicaments communément appelés persisters. Les procédés existants pour la mesure de la pénétration du médicament dans les lésions de la tuberculose comportent in vivo coûteuses et longues études pharmacocinétiques couplés à des techniques de bioanalyse ou d&#39; imagerie. A été proposé La mesure in vitro du médicament se liant à des macromolécules caseum comme une alternative à ces techniques étant donné que cette liaison entrave la diffusion passive de molécules de médicament à travers caseum. dialyse d&#39;équilibre rapide est un système rapide et fiable pour effectuer des protéines plasmatiques et des études de liaison de tissus. Dans ce protocole, nous avons utilisé un dispositif de dialyse d&#39;équilibre rapide (RED) pour mesurer la liaison à la drogue broyats de caseum qui est EXCISDes lésions et des caries des lapins infectés par la tuberculose. Le protocole décrit également comment générer une matrice de substitution à partir de macrophages THP-1 chargés de lipides à utiliser à la place du caséum. Cet essai de liaison caseum / substitution est un outil important dans la découverte de médicaments contre la tuberculose et peut être adapté pour aider à étudier la distribution de médicaments dans des lésions ou des abcès causés par d&#39;autres maladies.

À l&#39;aide de ce protocole, nous avons testé des centaines de composés de développement de médicaments contre la tuberculose pour leur efficacité prédite à la casée pénétrante. La figure 1 permet de visualiser les concepts de base du dosage RED. La membrane de dialyse des inserts RED permet aux petites molécules non liées de se diffuser du puits du donneur au bien récepteur, atteignant finalement un équilibre entre les deux compartiments. Les petites mol...

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An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Nous décrivons ici une méthode de dialyse à l&#39;équilibre rapide (RED) pour mesurer la liaison du médicament à la caséine à partir de lésions et cavités de la tuberculose pulmonaire. Le protocole est également utilisé avec une matrice dérivée de macrophages en mousse qui est un substitut efficace à la casée.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensemble de liaison de caséine qui prédit la pénétration des drogues dans les lésions tuberculeuses

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

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An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

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11.7K vues.  Rutgers.  Nous décrivons ici une méthode de dialyse à l'équilibre rapide (RED) pour mesurer la liaison du médicament à la caséine à partir de lésions et cavités de la tuberculose pulmonaire. Le protocole est également utilisé avec une matrice dérivée de macrophages en mousse qui est un substitut efficace à la casée. 

Vidéo: An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Recherche

Immunologie et infection

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

Visualisation de l&#39;Agar Charcoal résazurine Essai pour semi-quantitative, Moyen-débit Enumération des mycobactéries

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Système d&#39;efficacité et de dépistage des inhibiteurs Cytotoxicité ciblage intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Un haut-débit Assay Compatible pour évaluer l&#39;efficacité des médicaments contre Macrophage repiquées<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological substance. For the sake of the workers&#8217; safety, handling of all samples presumed to carry Mtb must be conducted in a containment level (CL) 3 laboratory. The TB molecular bacterial load assay (TB-MBLA) test is a reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) test that quantifies Mtb bacillary load using primers and dual-labelled probes for 16S rRNA. We describe the use of heat inactivation to render TB samples noninfectious while preserving RNA for the TB-MBLA. A 1 mL aliquot of the sputum sample in tightly closed 15 mL centrifuge tubes is boiled for 20 min at either 80 &#176;C, 85 &#176;C, or 95 &#176;C to inactivate Mtb bacilli. Cultivation of the heat inactivated and control (live) samples for 42 days confirmed the death of TB. The inactivated sample is then spiked with 100 &#181;L of the extraction control and RNA is extracted following the standard RNA isolation procedure. No growth was observed in the cultures of heat treated samples. The isolated RNA is subjected to real-time RT-qPCR, which amplifies a specific target in the Mtb 16S rRNA gene, yielding results in the form of quantification cycles (Cq). A standard curve is used to translate Cq into bacterial load, or estimated colony forming units per mL (eCFU/mL). There is an inverse relationship between Cq and the bacterial load of a sample. The limitation is that heat inactivation lyses some cells, exposing the RNA to RNases that cause a loss of &#60;1 log10eCFU/mL (i.e., &#60;10 CFU/mL). Further studies will determine the proportion of very low burden patients that cause false negative results due to heat inactivation.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA

We describe a tuberculosis molecular bacterial load assay test performed after heat inactivation of sputum. Heat inactivation renders sputum samples noninfectious and obviates the need for containment level 3 laboratories for tuberculosis molecular tests.

Un essai de charge bactérienne moléculaire de la tuberculose (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel therapeutics are urgently required. The ability of dosed TB drugs to reach and sterilize bacteria within poorly-vascularized necrotic regions (caseum) of pulmonary granulomas is crucial for successful therapeutic intervention. Effective therapeutic regimens must therefore contain drugs with favorable caseum penetration properties. Current LC/MS methods for quantifying drug levels in biological tissues have limited spatial resolution capabilities, making it difficult to accurately determine absolute drug concentrations within small tissue compartments such as those found within necrotic granulomas. Here we present a protocol combining laser capture microdissection (LCM) of pathologically-distinct tissue regions with LC/MS quantification. This technique provides absolute quantification of drugs within granuloma caseum, surrounding cellular lesion and uninvolved lung tissue and, therefore, accurately determines whether bactericidal concentrations are being achieved. In addition to tuberculosis research, the technique has many potential applications for spatially-resolved quantification of drugs in diseased tissues.

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Here, we describe a protocol using laser capture microdissection coupled with LC/MS analysis to spatially-quantify drug distributions within pulmonary tuberculosis granulomas. The approach has broad applicability to quantifying drug concentrations within tissues at high spatial detail.

Quantification spatiale des drogues dans les lésions de la tuberculose pulmonaire par Laser capturer Microdissection liquide chromatographie en spectrométrie de masse (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Médecine

An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent of COVID-19. Mtb has evolved to persist in its intracellular environment, evade host defenses, and has developed resistance to many anti-tubercular drugs. One approach to solving resistance is identifying existing&#160;approved drugs that will boost the host immune response to Mtb. These drugs could then be repurposed as adjunctive host-directed therapies (HDT) to shorten treatment time and help overcome antibiotic resistance.
Quantification of intracellular Mtb growth in macrophages is a crucial aspect of assessing potential HDT. The gold standard for measuring Mtb growth is counting colony-forming units (CFU) on agar plates. This is a slow, labor-intensive assay that does not lend itself to rapid screening of drugs. In this protocol, an automated, broth-based culture system, which is more commonly used to detect Mtb in clinical specimens, has been adapted for preclinical screening of host-directed therapies. The capacity of the liquid culture assay system to investigate intracellular Mtb growth in macrophages treated with HDT was evaluated. The HDTs tested for their ability to inhibit Mtb growth were all-trans Retinoic acid (AtRA), both in solution and encapsulated in poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles and the combination of interferon-gamma and linezolid. The advantages of this automated liquid culture-based technique over the CFU method include simplicity of setup, less labor-intensive preparation, and faster time to results (5-12 days compared to 21 days or more for agar plates).

Rapid and efficient quantification of intracellular M. tuberculosis growth is crucial for pursuing improved therapies against tuberculosis (TB). This protocol describes a broth-based colorimetric detection assay using an automated liquid culture system to quantify Mtb growth in macrophages treated with candidate host-directed therapies.

Système de culture automatisé destiné à être utilisé dans les essais précliniques de thérapies dirigées par l’hôte pour la tuberculose

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent ...

<meta charset="utf8"></head><body>Essai de dépistage à haut débit de Mycobacterium abscessus à l’aide de deux rapporteurs

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Pleins feux sur l’auteur : Protocole de dépistage de médicaments évolutif pour une découverte efficace des traitements de M. abscessus

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

Développement d’un test pour le criblage de médicaments à haut débit contre les mycobactéries

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

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