Мы хотели бы поблагодарить Johnson &amp; Johnson, Альянс TB, Astra Zeneca, Rib-X и Триус Therapeutics для обеспечения bedaquiline, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid и тедизолид соответственно. Брендан Прайдо, Мэтью Циммерман, Стивен Джузвин, Эмма Рей-Хурадо, Нэнси Руел, Льян Ли и Даниэла Вайнер оказывал поддержку с анализом MALDI, биоаналитических методов, подготовки caseum суррогата, химический синтез и выделение кролика caseum. Эта работа была проведена при финансовой поддержке Фонда Билла и Мелинда Гейтс, удостоенный # OPP1044966 и OPP1024050 к V Дартуа, NIH Shared Instrumentation Грант S10OD018072, а также совместного финансирования со стороны Фонда Билла и Мелинды Гейтс и Wellcome Trust для центра передового опыта для свинца оптимизации для болезней развивающегося мира P Уайат.

Все исследования на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здоровья с одобрения Комитета по институциональному уходу и использованию животных NIAID (NIH), Bethesda, MD. Все исследования с участием M. tuberculosis проводились в лаборатории с уровнем биологической безопасности 3 (BSL-3). 1. Модель заражения кроликов и коллекция казума <ol><li> Инфицируйте белых кроликов Новой Зеландии с M. tuberculosis, используя аэрозольную систему воздействия носа только, как описано выше. 12 , 13 Позвольте инфекции прогрессировать в течение 12-16 недель. Седате кроликов с 35 мг / кг кетамина и 5 мг / кг ксилазина внутримышечно, эвтаназии кроликов с 0,22 мл / кг пентобарбитала натрия и фенитоин натрия внутривенно и приступить к вскрытии. </li><li> Используя пинцеты и скальпель, удалите легкие из сундука caVity. Из каждой легочной доли вырезают отдельные полости и крупные некротические гранулемы с помощью скальпеля. Тщательно очистите казум от полостей и гранулемы. Взвешивают, записывают и хранят образцы в пробирках с 2-миллилитровыми пробками при -20 ° C до готовности к использованию. </li><li> Гамма-облучение образцов инфекционного кадзума в 3 MegaRad на сухом льду, чтобы сделать их неинфекционными и безопасными для использования в лаборатории BSL-2. </li></ol> 2. In vitro генерирование суррогата кардиума из клеток ТНР-1 <ol><li> Выращивают моноциты THP-1 в среде RPMI 1640 (2 мМ L-глутамина и 10% фетальной бычьей сыворотки) в колбах для культивирования клеток Т175 (80 мл / колбу). Инкубируйте колбы в атмосфере 5% CO 2 при 37 ° C в течение 3-4 дней. </li><li> Центрифуга культуры из T175 колбу в двух 50 мл конических труб на 150 xg в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и суспендируйте осадок в 10 мл среды RPMI 1640. </li><li> Внесите 5 мкл этой культуры в 1,5 мл пробирку, содержащую 45 мкл tRypan голубой. Тщательно перемешать с помощью пипетки. Перенесите 10 мкл на гемоцитометр и подсчитайте количество жизнеспособных моноцитов THP-1 (неокрашенных), используя световой микроскоп (10-кратное увеличение). Рассчитайте количество жизнеспособных клеток на мл культуры. Разбавьте его средой RPMI до конечной плотности 1,25 × 10 6 клеток / мл. </li><li> Нагрузка 40 мл культуры на большой планшет для культуры клеток (50 × 10 6 клеток / планшета). Добавить 40 мкл 100 мкМ РМА (форбол 12-миристат-13-ацетата, приготовленного в этаноле) и позволить клеткам прилипать в течение ночи в инкубаторе. ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация PMA составляет 100 нМ. </li><li> Разбавляют чистую олеиновую кислоту (ОА) (0,89 г / мл) в этаноле до концентрации 0,1 М ( то есть 31,7 мкл ОА в 968,3 мкл этанола). Развести этот раствор в свежей предварительно нагретой среде RMPI до концентрации 10 мМ. Развести эту суспензию ОА до 0,4 мМ (конечная рабочая концентрация) в среде RPMI, предварительно нагретой до 37 ° С. </li><li> Удалить существующие носители и-adhered клетки из клеточной культуры пластин и осторожно добавляют 40 мл 0,4 мМ ОА в макрофагах THP-1 (ТНР-M). Инкубируют при 37 ° С в инкубаторе в течение ночи. </li><li> С помощью светового микроскопа при 40-кратном увеличении, чтобы визуально подтвердить наличие многочисленных липидных включений тела в каждом ТНР-М. Удалить все среды RPMI из клеточной культуры пластин и осторожно вымыть прилипшие клетки дважды фосфатно-буферный раствор (PBS) с помощью серологической пипетки на 50 мл. Примечание: липидные тела появляются как маленькие, четкие, сферические структуры в цитоплазме ТНР-М. </li><li> Добавить 40 мл 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в PBS в каждую чашку. Инкубируют в течение 15 мин при 37 ° С. </li><li> Отсоедините пенистые макрофаги (FM), несколько раз пипетирования вверх и вниз по поверхности всей пластины с помощью серологической пипетки 10 мл. Передача клеточной суспензии в коническую пробирку на 50 мл и спином вниз со скоростью 150 мкг в течение 5 мин. </li><li> Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл PBS (третий промывной PBS), ай передаче предварительно взвешенные конические пробирки 15 мл. Спин вниз снова при 150 мкг в течение 5 мин. Тщательно аспирата супернатант с помощью серологической пипетки и выбросьте. </li><li> Тема с FM гранул до 3 циклов замораживания-оттаивания, чтобы лизировать клетки, и инкубируют их при 75 ° С в течение 20-30 мин для денатурации белков в матрице. Храните гранулы при температуре -20 ° С до готовности к использованию. </li></ol> 3. Быстрое Уравновешивание Диализ (КРС) Анализ <ol><li> Готовят 10 мМ исходные растворы всех исследуемых соединений в диметилсульфоксиде (ДМСО). Разбавить до 500 мкМ рабочих растворов в ДМСО до каждого анализа. </li><li> Взвесить трубку, содержащую caseum суррогатной осадок. Отнимите вес порожней трубки, чтобы получить вес гранул в одиночку. Добавьте 2-3 металлические шарики на пробирку и, используя гомогенизатор ткани на 1200 ударов / мин в течение 1 мин, нарушить caseum или суррогатной матрицу в PBS (1: 9 вес / объем), чтобы достичь 10x разбавленной суспензии каждой матрицы. </li><li> Spike 6,5 мкл 500МкМ раствора испытуемого соединения в 643,5 мкл гомогената для достижения конечной концентрации 5 мкМ (≤1% ДМСО) и вихря. </li><li> Поместите КРАСНЫЕ вставки в основание. Добавить 200 мкл матрицы с лекарственным покрытием в донорную камеру (красное кольцо) каждой красной вставки и 350 мкл PBS в каждую камеру-приемник. Подготовьте 3 вставки для каждого испытуемого соединения (образцы из трех экземпляров). Уплотнительную пластину с клеевым пластинчатым уплотнением и инкубировать при температуре 37 ° С на термомиксере при 200 об / мин (1 xg) в течение 4 часов. </li><li> После инкубации аккуратно перемешайте содержимое донорской и приемной камер с помощью пипетки вверх и вниз 2-3 раза. Внесите 20 мкл аликвоты гомогената из донорных камер и добавьте 20 мкл чистого PBS в 1,5 мл пробирку (1: 1). Аналогичным образом, пипеткой из 20 мкл аликвоты образцов PBS из приемной камеры и добавить 20 мкл чистого гомогената (матрица соответствия). 8 ПРИМЕЧАНИЕ. Матричное сопоставление исключает ne2-й изд отдельных калибровочных кривых (в гомогенате и PBS) должны быть сделан для количественного анализа. Содержание донора камеры может осаждаться в течение долгого времени. Аккуратно перемешать содержимое с помощью пипетки перед удалением аликвоты. </li></ol> 4. ЖХ-МС Количественное и анализ данных <ol><li> Добавьте 160 мкл 1: 1 метанол: ацетонитрил, содержащий 500 нг / мл диклофенак или 10 нг / мл верапамил (внутренний стандарт) в каждую пробирку и вихря для осаждения белков. Центрифуга при 10000 мкг в течение 5 мин для осаждения осадок и переноса супернатантов в 96-луночные глубоко-луночные планшеты для жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) анализа. 7 </li><li> Построение калибровочных кривых от 1-1000 нМ для каждого испытуемого соединения, сохраняя при этом тот же состав, как матрицу образцов выше. Количественно концентрацию тестируемого соединения в образцах от донора и приемника камеры с использованием метода ЖХ-МС. </li><li> Вычислить несвязанного фракции (е и) оF препарат в разбавленной матрице, используя уравнение 1. Вычислить f u в неразведенной матрице, используя уравнение 2 ( D = коэффициент разбавления 10). 14 <img alt="Уравнение 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" /> <img alt="Уравнение 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" /></li><li> Проверьте восстановление (баланс массы) каждого соединения, используя уравнение 3 для идентификации соединений с проблемами стабильности / метаболизма / неспецифического связывания. ПРИМЕЧАНИЕ. Восстановление обычно составляет от 70% до 130%. 15 <img alt="Уравнение 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" /></li></ol>

<ol>
	<li>Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+versus+bugs:+in+pursuit+of+the+persistent+predator+Mycobacterium+tuberculosis.">Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+dormant+tubercle+bacilli+and+latent+tuberculosis.">Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis.</a> Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).</li><li>Aber, V. R., Nunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+chemotherapy+of+tuberculosis.+Factors+affecting+relapse+following+short+term+chemotherapy.">Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy.</a> Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).</li><li>Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nested+case-control+study+on+treatment-related+risk+factors+for+early+relapse+of+tuberculosis.">A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).</li><li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+of+anti-tuberculosis+drugs:+from+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells.">The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions.">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li><li>Sarathy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+Drug+Penetration+in+Tuberculosis+Lesions.">Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions.</a> ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).</li><li>Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+rapid+equilibrium+dialysis+approach+for+the+measurement+of+plasma+protein+binding.">Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding.</a> J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).</li><li>Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Equilibrium+Dialysis+(RED):+an+In-vitro+High-Throughput+Screening+Technique+for+Plasma+Protein+Binding+using+Human+and+Rat+Plasma.">Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma.</a> J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbound+drug+concentration+in+brain+homogenate+and+cerebral+spinal+fluid+at+steady+state+as+a+surrogate+for+unbound+concentration+in+brain+interstitial+fluid.">Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid.</a> Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).</li><li>Able, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+localization,+native+tissue+binding+and+ex+vivo+occupancy+for+centrally+penetrant+P2X7+antagonists+in+the+rat.">Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat.</a> Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).</li><li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits:+a+failed+host+immune+response.">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).</li><li>Via, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculous+Granulomas+are+Hypoxic+in+Guinea+pigs,+Rabbits,+and+Non-Human+Primates.">Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates.</a> Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).</li><li>Kalvass, J. C., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+nonspecific+brain+and+plasma+binding+on+CNS+exposure:+implications+for+rational+drug+discovery.">Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery.</a> Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).</li><li>Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+recovery+on+fraction+unbound+using+equilibrium+dialysis.">Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis.</a> J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).</li><li>Lenaerts, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+persisting+mycobacteria+in+a+Guinea+pig+model+of+tuberculosis+revealed+by+r207910.">Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li></ol>

Конкурирующих финансовых интересов нет.

Легочные некротические поражения и полости у больных туберкулезом содержат субпопуляции бактерий, которые не поддаются лечению. Казеозные ядра этих структур особенно ответственны за укрывательство этих персистеров во внеклеточной среде. Благоприятное распределение антибактериаль...

Лечение туберкулеза легких требует эффективного распределения препаратов в различных типах поражений. Некротические поражения и полости содержат казеозные центры, которые содержат субпопуляции лекарственно-устойчивых или «стойких» бактерий. 1 , 2 Кавитационная болезнь связана с низкими показателями излечения и плохим прогнозом. 3 , 4 Предыдущие исследования показали, используя количественные методы и методы визуализации, что способность проникать в казуум значительно варьирует от одного класса наркотиков к другому. 5 , 6 Эти методы, однако, требуют использования моделей заражения животных, которые являются медленными и утомительными. Был разработан тест in vitro, который измеряет связывание лекарственного средства с ex vivo caseum. Было установлено, что это связывание обратно коррелирует с проникновением лекарств в казеозные гранулемы и, следовательно, являетсяиспользуется в качестве инструмента прогнозирования. 7 Равновесие диализ рассматриваются как золотой стандарт подхода к белкам плазмы исследованию связывания. Быстрый равновесный диализ (RED) устройство обеспечивает быструю, легкую в использовании и надежную систему для выполнения таких анализов. 8 Устройство состоит из двух компонентов: одноразовое использование, одноразовых вкладышей , состоящих из 2 -х камер , разделенных вертикального цилиндра полупроницаемой мембраны; и повторно используемые базовые пластины, которые могут содержать до 48 вставок в то время. Диализ мембрана имеет 8 кД молекулярной массы срез (MWCO), что идеально подходит для исследования связывания с наркотиками макромолекулы. Высокое отношение площади поверхности к объему мембранного отсека позволяет быстро диализ и уравновешивание. Обе вставка и базовая пластина были проверены для минимально неспецифического связывания. Сочетание RED устройства с биоаналитическими методами обеспечивает точные оценки несвязанных фракций лекарственных средств в рЛАЗМА. 8, 9 Хотя первоначально предназначено для измерения связывания с белками плазмы, КРАСНОЕ устройство используется в нескольких тканях исследования связывания с использованием гомогенат. 10, 11 В этом протоколе, мы оцениваем препарат связывания с caseum, некротическим мусор вырезал из некротических поражений и полостей туберкулеза-инфицированных кроликов. Бесклеточное и не сосудистое характер казеозного материала позволяет легко гомогенизировать в гомогенную суспензию, который совместит с анализом. Учитывая, что caseum утомительно производить и трудно найти, протокол также был утвержден для использования с суррогатной матрицей, получают из пенистых макрофагов. ТНР-1 моноцитов макрофаги индуцируются с олеиновой кислотой, чтобы накопить несколько липидных тел, которые дают им их «пенистый» внешний вид. Эти липидные загруженные клетки собирают иОбрабатывается для получения матрицы, которую мы используем в качестве суррогата caseum. Это исследование показало, что связывание лекарственного средства с этой суррогатной матрицей хорошо коррелирует со связыванием с казумом, эффективно имитируя процесс in vivo , который препятствует проникновению наркотиков в казеозную сердцевину гранулем и полостей.

<table><tbody><tr><td>New Zealand White Rabbits</td><td>Covance</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution&amp;nbsp;</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 monocytic cell line</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>175 cm&amp;sup2; TC-Treated Flask (T175)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-3400-175</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 media w/o glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091003IR</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone L-glutamine, 200 mM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-2881-1</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15178101</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Device Reusable Base Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89811</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Device Inserts, 50/box&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89809</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED insert removal tool&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>89812</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive plate seal</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Diclofenac sodium salt</td><td>Sigma</td><td>93484</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>2010 Geno/Grinder</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-158</td><td></td></tr><tr><td>484R Cobalt 60 Irradiator</td><td>JL Shepard</td><td>7810-484-1</td><td></td></tr><tr><td>INCYTO&amp;nbsp;C-Chip Disposable Hemacytometers</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td></td></tr><tr><td>Upright Light Microscope</td><td>Leica</td><td>DM1000</td><td></td></tr><tr><td>Binary Liquid Chromatography system</td><td>Agilent</td><td>1260</td><td>Multi-compenent</td></tr><tr><td>Mass spectrometer</td><td>AB Sciex</td><td>4000</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro caseum binding assay that predicts drug penetration in tuberculosis lesions

Для искоренения туберкулеза необходимы схемы лекарств, которые могут проникать во множество слоев сложных легочных очагов. Распределение лекарств в казеозных ядрах полостей и поражений особенно важно, поскольку они содержат субпопуляции лекарственно-толерантных бактерий, которые также часто называют персистерами. Существующие методы измерения проникновения лекарств в очаги туберкулеза требуют дорогостоящих и длительных исследований фармакокинетики in vivo в сочетании с методами биоанализа или визуализации. В качестве альтернативы таким методам было предложено измерение связывания лекарства с макромолекулами кадьюма in vitro, поскольку это связывание препятствует пассивной диффузии молекул лекарственного средства через казум. Быстрорадикальный диализ - это быстрая и надежная система для проведения исследований связывания с белками плазмы и тканей. В этом протоколе мы использовали прибор с быстрым равновесным диализом (RED) для измерения связывания лекарственного средства с гомогенатами казума, который представляет собой эксцизиюВызванных поражениями и полостями инфицированных туберкулезом кроликов. Протокол также описывает, как создать суррогатную матрицу из макрофагов THP-1, нагруженных липидами, для использования вместо казума. Этот анализ казума / суррогатного связывания является важным инструментом при обнаружении лекарств от туберкулеза и может быть адаптирован для изучения распределения лекарственных средств при поражениях или абсцессах, вызванных другими заболеваниями.

Используя этот протокол, мы опробовали сотни препаратов для разработки лекарств против туберкулеза для их прогнозируемой эффективности в проникающем казуме. На рисунке 1 представлены основные понятия анализа RED. Диализная мембрана красных вставок позволяе?...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions at JoVE.com

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Здесь мы описываем метод быстрого равновесного диализа (RED) для измерения связывания лекарственного средства с казумом от поражений и полостей легочного туберкулеза. Протокол также используется с матрицей, полученной из пенистого макрофага, которая является эффективным суррогатом казума.

<em&gt; In Vitro</em&gt; Анализ связи с казумом, который прогнозирует проникновение наркотиков в очаги туберкулеза

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

an-vitro-caseum-binding-assay-that-predicts-drug-penetration

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Pharmacokinetics and Pharmacodynamics

Pharmacology

Immunology and Infection

Unit 1

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Nonlinear Pharmacokinetics

Introduction to Respiratory System Drugs

SCIENTISTS IN ACTION

11.7K Views.  Rutgers.  Здесь мы описываем метод быстрого равновесного диализа (RED) для измерения связывания лекарственного средства с казумом от поражений и полостей легочного туберкулеза. Протокол также используется с матрицей, полученной из пенистого макрофага, которая являетс...

Video: An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Микроскопический фенотипический анализ для количественной оценки внутриклеточных микобактерий, адаптированных для скрининга с высокой пропускной способностью/высоким содержанием

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

Визуализация Charcoal Agar резазурин Пробирной для полуколичественного, средне-пропускной Перечень микобактерий

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Система для эффективности и цитотоксичности скрининга ингибиторов Таргетинг внутриклеточных<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Высокая пропускная способность Совместимость анализа для оценки эффективности против наркотиков пассировать макрофагов<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological substance. For the sake of the workers&#8217; safety, handling of all samples presumed to carry Mtb must be conducted in a containment level (CL) 3 laboratory. The TB molecular bacterial load assay (TB-MBLA) test is a reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) test that quantifies Mtb bacillary load using primers and dual-labelled probes for 16S rRNA. We describe the use of heat inactivation to render TB samples noninfectious while preserving RNA for the TB-MBLA. A 1 mL aliquot of the sputum sample in tightly closed 15 mL centrifuge tubes is boiled for 20 min at either 80 &#176;C, 85 &#176;C, or 95 &#176;C to inactivate Mtb bacilli. Cultivation of the heat inactivated and control (live) samples for 42 days confirmed the death of TB. The inactivated sample is then spiked with 100 &#181;L of the extraction control and RNA is extracted following the standard RNA isolation procedure. No growth was observed in the cultures of heat treated samples. The isolated RNA is subjected to real-time RT-qPCR, which amplifies a specific target in the Mtb 16S rRNA gene, yielding results in the form of quantification cycles (Cq). A standard curve is used to translate Cq into bacterial load, or estimated colony forming units per mL (eCFU/mL). There is an inverse relationship between Cq and the bacterial load of a sample. The limitation is that heat inactivation lyses some cells, exposing the RNA to RNases that cause a loss of &#60;1 log10eCFU/mL (i.e., &#60;10 CFU/mL). Further studies will determine the proportion of very low burden patients that cause false negative results due to heat inactivation.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA

We describe a tuberculosis molecular bacterial load assay test performed after heat inactivation of sputum. Heat inactivation renders sputum samples noninfectious and obviates the need for containment level 3 laboratories for tuberculosis molecular tests.

Анализ молекулярной бактериальной нагрузки на туберкулез (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel therapeutics are urgently required. The ability of dosed TB drugs to reach and sterilize bacteria within poorly-vascularized necrotic regions (caseum) of pulmonary granulomas is crucial for successful therapeutic intervention. Effective therapeutic regimens must therefore contain drugs with favorable caseum penetration properties. Current LC/MS methods for quantifying drug levels in biological tissues have limited spatial resolution capabilities, making it difficult to accurately determine absolute drug concentrations within small tissue compartments such as those found within necrotic granulomas. Here we present a protocol combining laser capture microdissection (LCM) of pathologically-distinct tissue regions with LC/MS quantification. This technique provides absolute quantification of drugs within granuloma caseum, surrounding cellular lesion and uninvolved lung tissue and, therefore, accurately determines whether bactericidal concentrations are being achieved. In addition to tuberculosis research, the technique has many potential applications for spatially-resolved quantification of drugs in diseased tissues.

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Here, we describe a protocol using laser capture microdissection coupled with LC/MS analysis to spatially-quantify drug distributions within pulmonary tuberculosis granulomas. The approach has broad applicability to quantifying drug concentrations within tissues at high spatial detail.

Пространственная количественного определения наркотиков в поражении туберкулезом легких лазером захватить Microdissection жидкость хроматографии масс-спектрометрия (LCM-LC/МС)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Medicine

An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent of COVID-19. Mtb has evolved to persist in its intracellular environment, evade host defenses, and has developed resistance to many anti-tubercular drugs. One approach to solving resistance is identifying existing&#160;approved drugs that will boost the host immune response to Mtb. These drugs could then be repurposed as adjunctive host-directed therapies (HDT) to shorten treatment time and help overcome antibiotic resistance.
Quantification of intracellular Mtb growth in macrophages is a crucial aspect of assessing potential HDT. The gold standard for measuring Mtb growth is counting colony-forming units (CFU) on agar plates. This is a slow, labor-intensive assay that does not lend itself to rapid screening of drugs. In this protocol, an automated, broth-based culture system, which is more commonly used to detect Mtb in clinical specimens, has been adapted for preclinical screening of host-directed therapies. The capacity of the liquid culture assay system to investigate intracellular Mtb growth in macrophages treated with HDT was evaluated. The HDTs tested for their ability to inhibit Mtb growth were all-trans Retinoic acid (AtRA), both in solution and encapsulated in poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles and the combination of interferon-gamma and linezolid. The advantages of this automated liquid culture-based technique over the CFU method include simplicity of setup, less labor-intensive preparation, and faster time to results (5-12 days compared to 21 days or more for agar plates).

Rapid and efficient quantification of intracellular M. tuberculosis growth is crucial for pursuing improved therapies against tuberculosis (TB). This protocol describes a broth-based colorimetric detection assay using an automated liquid culture system to quantify Mtb growth in macrophages treated with candidate host-directed therapies.

Автоматизированная система культивирования для использования в доклиническом тестировании методов лечения туберкулеза, направленных на хозяина

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent ...

<meta charset="utf8"></head><body>Высокопроизводительный скрининговый анализ на Mycobacterium abscessus с использованием двойных репортеров

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>В центре внимания автора: Масштабируемый протокол скрининга лекарств для эффективного обнаружения методов лечения M. abscessus

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

Разработка анализа для высокопроизводительного скрининга лекарственных препаратов против микобактерий

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

Резюме

Смотреть дополнительные видео

PLAYLIST