Financement : Ce travail a été financé par l’Institut National impériale pour Health Research (NIHR) Biomedical Research Centre (BRC), le NIHR santé Protection Research Unit (HPRU) dans les Infections respiratoires à l’Imperial College London en partenariat avec l’Angleterre de santé publique (PHE) et le Centre de recherche translationnelle NIHR impériale sécurité des patients. Les opinions exprimées sont celles des auteurs et pas nécessairement ceux du NHS, le NIHR, ministère de la santé ou santé publique de l’Angleterre.

Les techniques utilisées dans le protocole suivant ont été approuvés par le West London Research Ethics Committee (numéro de référence 15/lO/0444).
1. nasale Absorption (NA)
<ol><li>
Préparation avant l’échantillonnage NA
	<ol>
<li>Lorsqu’on effectue des NA, tout d’abord se laver les mains et mettez des gants, de préférence devant le patient.</li>
		<li>Inspecter la cavité nasale à l’aide d’une lampe frontale et ont les cliniciens utilisent leur pouce non dominante pour rétracter le nez du patient afin de visualiser la cavité nasale. Remarque : Un spéculum nasal n’est pas généralement nécessaire.</li>
		<li>Visualiser la cavité nasale et inférieure cornet avant l’échantillonnage. Remarque : Les narines (narines) ne sont pas ronds en coupe transversale et ils vont tout droit vers l’arrière. Généralement, le cornet inférieure peut être vu comme un renflement ou une indentation sur la paroi latérale de la narine, avec la cloison nasale formant le mur lisse, plat médial. Nous voulons échantillon de cet inférieur cornets, puisque l’épithélium sous-jacent est un épithélium cilié simple des voies respiratoires44.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Échantillonnage de NA
	<ol>
<li>Lors de l’échantillonnage, passez le SAM NA doucement vers le haut de la lumière de la narine, orienter, qu’il soit à plat contre le cornet inférieur.</li>
		<li>Demandez les donateurs d’utiliser l’index pour appuyer sur le SAM sur la muqueuse nasale. NA peut provoquer un léger chatouillement, avec larmoiements possible, comme le Fonds multilatéral est absorbé. Remarque : Chez les adultes, nous réalisons généralement NA pendant 60 s.</li>
		<li>Après absorption du MLF, retirez l’appareil de NA de la narine et replacé dans le tube d’origine.</li>
		<li>Traiter les échantillons immédiatement dans le laboratoire ou congelez-les, tel que décrit plus loin dans le présent protocole. Remarque : NA est étudiée dans une variété de modèles défi muqueuse nasale, ainsi que dans les maladies des voies respiratoires différents. Toutefois, la validation contre les autres méthodes d’échantillonnage respiratoire doit être exécutée pour chaque population de l’étude et le patient.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. bronchique Absorption (BA)
<ol><li>
Préparation avant l’échantillonnage BA Remarque : BA est effectuée par personnel spécialisé dans une bronchoscopie.<ol>
<li>Avant de placer l’appareil de BA vers le bas de la sonde, vérifier que le SAM est d’extrusion et de retrait dans le cathéter.</li>
		<li>Avant d’effectuer le BA sur un patient, procéder à un simulacre BA sur un simulateur de bronchoscopie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Échantillonnage de BA
	<ol>
<li>Passez le bronchoscope vers le bas de la trachée et des bronches principales droite au niveau de bronche intermedius, proximale par rapport à la division dans le lobe inférieur droit et le juste milieu. Remarque : Nous généralement des échantillons de bronche intermedius, bien que d’autres sites dans les voies respiratoires peuvent être dégustés. Lors de l’observation du cathéter et SAM, on ne peut pas voir la pointe bronchoscope. Nous observons les simples étapes suivantes pour BA, une fois que le bronchoscope a atteint le site d’échantillonnage souhaitée.</li>
		<li>CATHÉTER vers le bas : Insérer le cathéter de BA dans le canal exploité du bronchoscope jusqu'à ce que la pointe blanche est visible dans les voies respiratoires, jusqu'à un maximum de 1 cm distal par rapport à la fin du bronchoscope. Tenir l’extrémité bronchoscope et le cathéter dans le centre de la lumière des voies aériennes. Prendre soin de minimiser le contact entre l’extrémité du cathéter et de la muqueuse bronchique pour réduire les risques d’abrasion de la muqueuse.</li>
		<li>SAM OUT : Appuyer sur la poignée de l’appareil de BA, afin que le SAM est extrudé dans la lumière de la voie aérienne lobe droit moyen ou inférieur droit. Sous vision directe, plier la pointe du bronchoscope afin d’assurer que le SAM est en contact avec le Fonds multilatéral sur la paroi des voies respiratoires. Laisser le SAM dans les voies respiratoires, à plat sur la paroi muqueuse pendant 30 s.</li>
		<li>SAM IN : Feuilletez le bronchoscope afin d’assurer que la sonde humide de SAM est droit et pas plié sur l’extrémité du cathéter. Si nécessaire, l’extrémité du cathéter et bronchoscope peut être réintroduite pour redresser le SAM. Sous vision directe, rétracter le SAM droit doucement dans le cathéter. Remarque : Si il est difficile de se rétracter le SAM dans le cathéter, retirer l’ensemble du dispositif avec SAM expulsé hors de la voie aérienne.</li>
		<li>CATHÉTER vers le haut : Retirer le cathéter entière du canal d’exploitation du bronchoscope.</li>
		<li>COUPÉ SAM : SAM est coupée avec des ciseaux stériles et est ensuite placée dans un cryotube sur la glace. Ces échantillons peuvent être traités avec des méthodes différentes, tel que décrit plus loin dans le présent protocole.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. traitement des échantillons de BA et de NA
Remarque : Il existe de nombreuses options pour le traitement en laboratoire d’échantillons résultant de NA et de BA. Ces protocoles visent à conserver les échantillons pour une utilisation ultérieure et pour éluer l’échantillon MLF de SAM.
<ol><li>
Options pour manipulation immédiate des échantillons de NA et BA
	<ol>
<li>Option 1 : Stocker le SAM humide sur la glace pendant quelques heures avant la poursuite de la procédure.</li>
		<li>Option 2 : Immédiatement deep freeze NA SAMs dans la collection tube. De même, geler SAMs BA en fioles cryogéniques après l’enlèvement, avec des ciseaux, de l’équipement d’échantillonnage.</li>
		<li>Option 3 : Placez le SAM détaché dans la mémoire tampon d’élution (300 µL) avant de traiter directement ou profond gel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Options du tampon d’élution pour échantillons de NA et de BA Remarque : Le choix du tampon d’élution de dépend de ce qui se passe à analyser dans l’échantillon MLF et nous proposons quatre grandes variantes :<ol>
<li>Utiliser un tampon préparés à l’avance, adapté pour les procédures de test immunologique. Ces tampons doivent contenir une petite quantité de détergent (0,05 %) ainsi que des protéines, par exemple, l’albumine sérique bovine (BSA) à 1 %.</li>
		<li>Alternativement, utilisez un tampon contenant une plus grande quantité de détergent, afin que la lyse cellulaire se produit. Remarque : Nous utilisons des tampons contenant Triton-X ou NP40 concentration de 1 %. Mémoires tampons de lysis de cellules permettent des cytokines intracellulaires et extracellulaires à être élue de la SAM et généralement lieu à des niveaux plus élevés de cytokines et chimiokines. Ces tampons doivent également contenir des protéines et sont composées avec BSA à 1 %.</li>
		<li>Pour les mesures de RNA, comme la PCR quantitative de l’ARN viral ou mesure hôte ARN, ajouter RNA extraction tampon directement à la SAM humide. Remarque : Tampons de chaotropes RNA extraction contiennent guanidinium qui dénature les protéines. Une alternative consiste à ajouter le tampon d’extraction RNA au fluide MLF éluée contenus dans le tampon de lyse dosage immunologique ou cellule.</li>
		<li>Utilisation des solvants organiques comme l’acide trifluoroacétique, pour l’extraction des lipides et des métabolites, pour évaluation par spectrométrie de masse. Remarque : Détails de tous ces réactifs sont inclus dans la section matériel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Technique d’élution
	<ol>
<li>Pour toutes les techniques d’élution ci-dessus, insérez le SAM dans un tube à centrifuger-micro 2 mL, ainsi que le tampon d’extraction souhaité.</li>
		<li>Vortex mélanger l’échantillon pendant 30 s pour laver le SAM de fluides faiblement attachées et biomolécules.</li>
		<li>Pour assurer le recouvrement de l’ensemble de l’échantillon, effectuer l’élution centrifuge en ajoutant le SAM humide à une filtre mini colonne qui s’insère dans le même tube 2 mL de micro-centrifugeuse sert à se laver. Remarque : Deux types de mini-colonne filtre peuvent être utilisés. Le premier contient uniquement une maille en plastique, qui tient le SAM en place, permettant l’élution complète des fluides. Alternativement, si vous travaillez avec des matières infectieuses, utiliser des filtres de spin avec une porosité de 0,22 µm. Ces filtres seront stériliser des échantillons et conviennent aux échantillons avec suspicion d’infection mycobactérienne. Toutefois, ces filtres doivent être préalablement incubées avec tampon, afin de minimiser la liaison des médiateurs au filtre par les interactions non spécifiques.</li>
		<li>Forceps stérilisé permet de transférer le SAM humide pour le filtre de l’essorage. Changer la pince entre les échantillons afin d’éviter la contamination.</li>
		<li>Centrifuger les échantillons pendant 20 min à 16 000 x g dans une centrifugeuse mini refroidissement à 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocole de l’exemple de Sommaire
	<ol>
<li>En laboratoire, étiquette 2 mL tubes micro-centrifuge pour prélèvement d’échantillons et d’ajouter le volume souhaité de la mémoire tampon d’élution (typiquement 300 µL pour NA ; 100 µL pour BA). Joint couvercle, puis posez sur la glace.</li>
		<li>Après échantillonnage (immédiatement ou dans le laboratoire), le SAM est retiré de la poignée avec une pincette et placées dans le tampon contenant le tube de prélèvement (produit à l’étape précédente). Assurez-vous que le bouchon du tube microcentrifuge est bien fermée et transférer les échantillons, sur la glace, au laboratoire pour un traitement ultérieur.</li>
		<li>Retirer les tubes contenant un tampon SAM et élution de leur gamme de conteneur et vortex de transfert pendant 30 s.</li>
		<li>À l’aide d’une pince stérile, enlever SAM et placer dans une colonne (avec ou sans filtre en acétate de cellulose 0,22 µm).</li>
		<li>Recueillir la mémoire tampon d’élution depuis le tube de prélèvement et de conserver.</li>
		<li>Placer la colonne, avec SAM, dans le tube de prélèvement original (ou une nouvelle si stérile filtrage échantillons) et ajouter le tampon collection pour faire tourner la colonne. De cette manière, le liquide de lavage traversera la colonne dans le tube de prélèvement, aidant à éluer l’échantillon de la SAM.</li>
		<li>Centrifuger les échantillons avec couvercles étanches (16 000 x g, 20 min, 4 ° C).</li>
		<li>Enlever les échantillons de la centrifugeuse et placer dans un rack.</li>
		<li>Ouvrez le couvercle scellé des tubes et supprimer la colonne contenant le SAM. Disposer de colonne SAM et essorage dans un conteneur à déchets approprié.</li>
		<li>Soigneusement les tubes aliquote l’éluat contenue dans le tube en étiquetés cryogénique. Enregistrer le volume total d’éluat et le volume de chaque aliquote.</li>
		<li>Transférer les tubes cryogéniques fermés dans un congélateur à-80 ° C et conserver debout jusqu'à l’utilisation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les résultats de techniques d’échantillonnage existantes des voies respiratoires sont considérés comme très variable ; techniques d’échantillonnage alternatives sont nécessaires pour normaliser la recherche dans ce champ5. NA BA permis de prélèvement du Fonds multilatéral de manière non invasive et ont un potentiel excitant pour mesurer les réponses immunitaires chez airways sains et malades. Ces techniques offrent de nombreux avantages potentiels sur les techniques existantes, y compris une plus grande tolérance, vitesse d’échantillonnage, la capacité de répéter fréquemment d’échantillonnage, réduire la variabilité inter-utilisateur et a diminué la dilution des médiateurs immunitaires5 . La durée d’absorption et de la technique de traitement utilisée doit être optimisée pour chaque étude et rigoureusement maintenue entre les événements d’échantillonnage. En outre, dans le cas de BA, le site d’échantillonnage dans les voies respiratoires doit être soigneusement répliqué entre les individus.
NA et en particulier de BA, sont encore relativement nouvelles techniques pour la recherche clinique. Toutefois, les avantages de ces techniques ont conduit à leur utilisation dans de nombreuses études, y compris la validation minutieuse contre des techniques alternatives5. Ces appareils sont maintenant disponibles comme portant un marquage CE des dispositifs prêts à l’emploi répandu dans la recherche en pneumologie. Tandis que NA et BA entraîner beaucoup plus petits volumes d’échantillon que les techniques alternatives d’échantillonnage, des concentrations plus élevées obtenues peuvent entraîner une plus grande sensibilité des médiateurs immunitaires de faible abondance.
Selon les applications en aval souhaitées, NA et BA échantillons peuvent être congelés directement pour un traitement ultérieur, renforcer l’étude de faisabilité dans un environnement de recherche clinique. Le protocole pour la manipulation des échantillons peut être adapté pour répondre à des applications particulières en aval. Les techniques de traitement suggéré peuvent être utilisés pour la collecte des protéines ou des acides nucléiques ou des médiateurs immunitaires lipidiques, mais doivent être optimisés pour chaque étude. En particulier, MLF peut être éluée avec différents tampons. Tout d’abord, buffer immunoessai peut servir à mesurer la muqueuse cytokines, chimiokines et anticorps6,45. Tampons avec des niveaux plus élevés de détergent permet également de garantir la lyse cellulaire se produit, ce qui permet l’inclusion des cytokines intra-cellulaire. Extraction de l’ARN de chaotropes tampons doivent être utilisés pour la détermination de l’infection virale, virale charger, hébergent des ARNm et le microbiome. Alternativement, des solvants organiques peuvent être utilisés pour la lipidomique et spectrométrie de masse.
En conclusion, absorption directe du MLF de muqueuses est une technique passionnante avec utilisation potentielle dans les maladies muqueuses respiratoires, gastro-intestinales, urogénitales et autres. Toutefois, ces techniques d’absorption prometteur exigeront la validation précise d’échantillonnage et traitement technique pour les épreuves individuelles (biomarqueurs) dans chaque cadre de la maladie. En outre, ces techniques de précision roman muqueux d’échantillonnage exigeront la validation contre échantillons conventionnels, tels que du sang, le souffle et expectoration. Avec ces techniques, MLF peut servir à mesurer les anticorps, cytokines, chimiokines, prostanoïdes et microbes.

La plupart des maladies respiratoires provoquent une réaction inflammatoire, et il y a un besoin urgent pour l’échantillonnage de la surface de la muqueuse respiratoire dans la bronchopneumopathie chronique obstructive, pulmonaire, la tuberculose, la rhinite allergique, asthme, infections virales et fongiques fibrose et poumon cancer 1. Aspiration nasopharyngée (NPA), lavage nasal et lavage broncho-alvéolaire (LBA) sont des techniques courantes pour prélever les voies respiratoires supérieures et inférieures. Toutefois, ces techniques présentent des problèmes considérables, y compris la mauvaise tolérance, dilution des médiateurs de l’inflammation et l’incapacité de répéter fréquemment d’échantillonnage2. Une solution de rechange à l’échantillonnage de l’APN est l’utilisation d’écouvillons, soit en nylon floqué, coton, ou rayonne3,4, mais elles aussi ont des limites, parce qu’ils l’inconfort et les dommages à l’épithélium nasal et dans une liaison irréversible de cas de 5de médiateurs inflammatoires. Ces techniques ne peuvent généralement être répétés en série plus d’une heure, et des techniques alternatives peuvent être plus efficaces pour la détection de faible abondance cytokines et chimiokines5,6. De plus, la variabilité de l’utilisateur associée à ces techniques peut générer des incohérences dans les données, ce qui entraîne l’obligation de grandes cohortes de patients.
Alternativement, les techniques d’absorption à l’aide d’éponges naturelles et synthétiques ont été utilisés pour recueillir des fonds multilatéral de muqueuses. Éponges ophtalmiques composé de cellulose normale (p. ex., Weck-cel) ont servi d’échantillon salive, col de l’utérus et les sécrétions vaginales,7. En outre, les éponges synthétiques fabriqués à partir d’alcool polyvinylique (PVA) et acétate de polyvinyle hydroxylé (HPVA) ont été utilisés8. Sept différents matériaux absorbants ont été comparées pour prélèvement d’échantillons de salive avant de mesurer les anticorps9, tandis que le polyuréthane mini-éponges ont été utilisés pour recueillir les larmes humaines10.
Papier filtre composé de cellulose normale de la plante de coton a été largement utilisé pour absorber les sécrétions nasales depuis le livre pionnier de Alam et ses collègues en 199211,12,13,14, 15,16,17. Produits à partir des cartes de filtre (par exemple Shandon) disques de papier filtre et ont été utilisés pour mesurer les histamines et cytokines après avoir contrôlé les défis allergène nasale et allergènes naturels exposition18,19 ,20,21. Toutefois, les différents lots de papier filtre varient dans leur degré de liaison aux protéines et certains ne parviennent pas à libérer des cytokines. Méthodes à l’aide d’une matrice d’absorption synthétique (MCS) ont donc été développés2,22,23. SAMs sont maintenant généralement utilisées pour obtenir MLF nasale par NA. Ces matériaux absorbants est agréables à utiliser et peut obtenir MLF même du nez enflammées à intervalles fréquents sur de longues périodes de temps.
L’absorption nasale est une forme de précision d’échantillonnage de muqueuse à l’aide de SAM pour l’échantillonnage du MLF dans les voies aériennes supérieures. Dispositifs de NA sont fabriqués comme portant un marquage CE des dispositifs médicaux à partir de matériaux de qualité médicale à l’aide de salles blanches et sont libres de poussière et les allergènes. L’échantillonneur de NA se compose d’une poignée et SAM dans un cryotube stérile. Le SAM est constitué de polymères, généralement des fibres, mais il est également disponible en tant que mousse, et ils sont sélectionnés pour être doux et absorbant, avec mèche rapide pour le prélèvement de. SAMs ont la liaison aux protéines minimale pour permettre l’élution efficace des sécrétions absorbées. NA est une technique très douce et non invasive pouvant être exécutées sur les donateurs de tous les âges. En outre, l’échantillonnage serial, même toutes les quelques minutes, est possible. NA a été validée contre existants des voies aériennes supérieures d’échantillonnage techniques5 et répétitive échantillonnage a permis de générer des données cinétiques suite à contestation de la voie aérienne avec l’allergène23,24,25, endotoxine bactérienne26 et virale de type TLR agonistes (JAI, a. et al., manuscrit en préparation). NA a également été utilisé chez le nourrisson pour étudier l’histoire naturelle de l’atopie27,28,29 et30de la bronchiolite virale.
Microprélèvement bronchoscopique (BMS) est une procédure de collecte de fonds multilatéral dans les voies respiratoires inférieures qui a été développé par Olympus31,32,33. Malheureusement, ce système BMS est seulement autorisé au Japon. Deux systèmes BMS d’alimentation Olympus : une avec un polyester hydroxylé fibreux (FHPE) sonde34,35,36,37, et une avec un coton sonde33,38, 39 , 40 , 41 , 42 , 43. un obstacle majeur a été que la sonde BMS utilisée chez les patients souffrant d’asthme causé contact muqueux hémorragie, avec la moitié de tous les échantillons contaminés par du sang. Les auteurs ont conclu qu’il n’était pas possible à échantillon MLF utilisant ce système BMS de périphériques airways dans l’asthme patients43.
Comme alternative, nous avons développé de BA à l’aide d’une SAM douce qui peut être effectué au cours d’une enquête bronchoscopique des voies respiratoires inférieures, notamment suite à l’infection expérimentale de sujets asthmatiques avec rhinovirus6. Le dispositif de la BA se compose de : un cathéter externe creux, une pièce à main qui, lors de l’activation, expulse le SAM et un fil de guidage en plastique central qui possède le SAM à son extrémité. En ce qui concerne les NA, kits de BA sont fabriqués avec des matériaux de qualité médicale à l’aide de salles blanches et sont libres de poussière et les allergènes. En outre, dispositifs de marque et sont sont fournis irradiation gamma. La bande de SAM est doux, absorbant et a mèche rapide pour prélèvement d’échantillons. Il a également la liaison aux protéines minimale pour permettre l’élution efficace des sécrétions absorbées. L’appareil peut s’adapter par le canal d’un bronchoscope et peut être utilisé pour rapidement et avec précision l’échantillon MLF à certains sites d’intérêt dans les voies respiratoires. Contrairement au BAL ou BMS, BA n’entraîne pas contacter saignement ou après la procédure supplémentaire inconfort pour le patient.
Une attention particulière devrait être portée au traitement des échantillons de NA et de BA. Les échantillons peuvent être directement congelés et transformés en lots ou peuvent être traitées immédiatement. Le type de traitement peut être adapté vers certaines applications en aval, y compris les immunoessais pour les cytokines, chimiokines et immunoglobulines ou elutions des virus, bactéries, et la cellule hôte associés RNA. Nous présentons la collection clinique et le laboratoire des techniques de traitement associés à NA et BA comme un guide pour les cliniciens-chercheurs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1562">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Nasosorption (adult, 7mm width)</td>
			<td style="width:108px;">Hunt Developments</td>
			<td style="width:140px;">NSFL-FXI-11</td>
			<td style="width:1061px;">Different sizes are available for different patient groups/ages.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Bronchosorption</td>
			<td style="width:108px;">Hunt Developments</td>
			<td style="width:140px;">BSFL-FXI-11</td>
			<td>Minimum bronchoscope channel size 2mm; Max working length 815mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Corning&#160;Costar&#160;Spin-X&#160;centrifuge tube filters (without membrane)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">CLS9301-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Corning&#160;Costar&#160;Spin-X&#160;centrifuge tube filters (0.22um membrane)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">CLS8160-24EA</td>
			<td>For sterilisation of samples with infection risk.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">Assay (elution) buffer</td>
			<td style="width:108px;">Millipore</td>
			<td style="width:140px;">AB-33k</td>
			<td>Not listed on the Millipore website but available through enquiry or general lab supply companies, such as Cedarlane. Contains 0.05% Tween-20 and 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">NP-40 Cell lysis buffer</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">FNN0021</td>
			<td>Add bovine serum albumin to 1% (w/v). Can recover higher absolute mediator levels.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">Buffer RLT (RNA extraction)</td>
			<td style="width:108px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:140px;">79216</td>
			<td>Allows recovery of RNA from nasosorption and bronchosorption samples.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">302031-100ML-M</td>
			<td>For elution of samples to be used in HPLC applications</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">2.0ml micro-centrifuge tubes</td>
			<td style="width:108px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:140px;">3213</td>
			<td>2ml tubes are required for the Spin-X tube filters, traditional 1.5ml tubes will not fit these.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absorption of nasal and bronchial fluids: precision sampling of the human respiratory mucosa and laboratory processing of samples

Les méthodes d’absorption nasale (NA) et d’absorption bronchique (BA) utilisent des matrices d’absorption synthétiques (SAM) pour absorber le liquide de la muqueuse (MLF) de l’appareil respiratoire humain. NA est une technique non invasive qui absorbe le fluide de le cornet inférieur et provoque une gêne minime. NA a donné des résultats reproductibles avec la possibilité de répéter fréquemment l’échantillonnage des voies aériennes supérieures.
En comparaison, les modes de prélèvement d’échantillons de la muqueuse respiratoire, tels que l’aspiration nasopharyngée (NPA) et le frottis conventionnel, sont plus invasifs et peuvent entraîner une plus grande variabilité de données. Autres méthodes ont des limites, par exemple, biopsies et procédures bronchiques sont envahissantes, expectorations contient de nombreux morts et mourir les cellules et nécessite de liquéfaction, condensat d’air expiré (EBC) contient de l’eau et la salive et échantillons de lavage sont dilués et variable.
BA peut être effectué par le canal d’un bronchoscope en clinique. L’échantillonnage est bien toléré et peut être réalisée à plusieurs endroits dans les voies respiratoires. BA se traduit par des échantillons MLF étant moins diluées que les échantillons (BAL) de lavage broncho-alvéolaire.
Cet article explique les techniques de NA et de BA, ainsi que le traitement en laboratoire des échantillons qui en résulte, qui peuvent être adaptés pour le biomarqueur aval souhaité étant mesuré. Ces techniques d’absorption sont des alternatives utiles aux techniques classiques d’échantillonnage utilisés dans la recherche clinique en pneumologie.

NA a été utilisé dans un certain nombre d’études permettant facilement et non invasive de mesurer l’inflammation des muqueuses. Après l’administration d’allergènes au nez, on peuvent observer des niveaux de prostaglandine-D2 (PGD2) à montent et descendent dans les minutes (Figure 1), en ligne avec la dégranulation des mastocytes (Thwaites et al., manuscrit en préparation). En outre, les médiateurs de l’inflammation de type II, telles que l’IL-5 (Figure 2, reproduit avec la permission du 24), peuvent être mesurés dans les heures qui suivent l’allergène nasale défi23,24. Dans les infections expérimentales d’asthmatiques allergiques et témoins sains, NA a été utilisé pour mesurer un panel de médiateurs, notamment l’interféron-gamma (IFN-γ), au cours des 7 jours (Figure 3, reproduit avec la permission de 6). En outre, dans l’infection naturelle virus respiratoire syncytial (RSV) des nourrissons, NA montré RSV pour être associée à des taux élevés de cytokines inflammatoires, telles que l’IFN-γ, par rapport aux non-VRS nourrissons atteints de bronchiolite et témoins sains ( Figure 4, réimprimé avec la permission de 30). Fait intéressant, cette discrimination entre RSV et non-VRS bronchiolite n’était pas significative dans les échantillons NPA apparié dans le temps (Figure 4).
BA a également été utilisé au cours de l’infection expérimentale des asthmatiques allergiques rhinovirus. Au jour 4 de l’infection de rhinovirus, niveaux d’IFN-γ, CXCL11, IL-10 et IL-5 ont été élevés de base (Figure 5; A, B, C et D, respectivement). En outre, cette technique a montré des niveaux élevés d’IL-5 dans les voies aériennes inférieures des asthmatiques allergiques au cours de l’infection de rhinovirus, par rapport aux témoins sains (Figure 5) (Figure 5 reproduit avec la permission de 6).
Ces résultats représentatifs sont extraits d’échantillons élués à l’aide du tampon d’essai contenant 0,05 % de Tween-20 et 1 % de BSA (voir Table des matières).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig1.jpg"> Figure 1 : Génération rapide et la clairance de la prostaglandine-D2 suite allergène nasale challenge. Des niveaux de prostaglandine-D2 (PGD2) mesurée à partir d’éluats absorption nasale dans les échantillons séries suite allergène nasale challenge avec le pollen d’herbe Timothy (n = 5). Chaque ligne représente les données d’un individu. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig2.jpg"> Figure 2 : Mesure cinétique d’IL-5 suite contestation allergène nasale. Production d’IL-5 dans les échantillons de série absorption nasale suite à contestation allergène nasale. Trois Répétez allergène défi études ont été menées, avec les participants (n = 19) recevant le placebo (bleu), à faible dose (10 mg) par voie orale prednisone (orange), ou prednisone par voie orale de doses élevées (25 mg) (rouge) une heure avant l’administration d’allergènes. Dénotent des lignes moyenne géométrique et les barres d’erreur sont des intervalles de confiance de 95 % de tous les participants. (Figure reproduit avec la permission de Leaker et coll., immunologie des muqueuses, 2017). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig3.jpg"> Figure 3 : Induction de l’interféron-γ pendant l’infection de rhinovirus. Au cours du défi d’infection des adultes sains (n = 11, bleu) et les asthmatiques allergiques (n = 28, rouge) avec le rhinovirus-16, prélèvement nasal d’absorption a été utilisé pour mesurer les niveaux de l’interféron-γ (IFN-γ). Données sont représentées comme parcelles A) crus spaghettis des individus et des niveaux B) médians avec des barres d’erreur qui dénote les gammes intervalle interquartiles. (Figure reproduit avec la permission de Hansel et al. 6). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig4.jpg"> Figure 4 : Nasosorption discriminatoire à l’interféron-γ élevé associé à l’infection par le VRS des nourrissons. Absorption nasale et l’aspiration nasopharyngée (NPA) ont été utilisés pour mesurer les niveaux de l’interféron-γ chez les nouveau-nés avec bronchiolite associée à une infection de virus respiratoire syncytial (VRS) (rouge, n = 12), un pathogène respiratoire non-VRS (vert, n = 12) et en bonne santé contrôles (bleu, n = 9). Données ont été analysées à l’aide d’un test de Kruskall-Wallis avec Dunns correction pour les comparaisons multiples (***p< 0,001). Lignes désigne les valeurs médianes et barres d’erreur sont ranges intervalle interquartiles. (Figure modifiée avec la permission de m. Thwaites et al. 30). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig4large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig5.jpg"> Figure 5 : Des médiateurs inflammatoires dans les échantillons d’absorption bronchique lors de l’infection de rhinovirus. Suite à une infection rhinovirus-16 des témoins sains (n = 10, bleu) et les volontaires asthmatiques allergiques (n = 23, rouge), absorption bronchique a été utilisée pour mesurer le niveau de A) IFN-γ, B) CXCL11, C) IL-10 et D) IL-5 au départ et le jour 4 de l’infection. Les données analysées par Wilcoxon signé rank test (échantillons appariés) et le test de Mann-Whitney (échantillons inégalées). Figure reproduit avec la permission de Hansel et al. 6 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Ce manuscrit décrit l’utilisation de techniques d’absorption nasal et bronchique, spécifiquement à l’aide de matrices d’absorption synthétiques (SAM) pour goûter le liquide de la muqueuse (MLF) des voies respiratoires supérieures et inférieures. Ces méthodes offrent la meilleure standardisation et la tolérance que les techniques d’échantillonnage respiratoires existants.

Absorption de liquides nasales et bronchiques : échantillonnage Precision de la muqueuse respiratoire humaine et traitement des échantillons en laboratoire

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

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29.2K vues.  St Mary's Hospital. Ce manuscrit décrit l’utilisation de techniques d’absorption nasal et bronchique, spécifiquement à l’aide de matrices d’absorption synthétiques (SAM) pour goûter le liquide de la muqueuse (MLF) des voies respiratoires supérieures et inférieures. Ces méthodes offrent la meilleure standardisation et la tolérance que les techniques d’échantillonnage respiratoires existants.

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Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Traitement des mammoplastie de réduction et de tissus humains mastectomie pour Culture Cellulaire

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Recherche

Médecine

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Méthodologie pour l’Induction de l’expectoration et traitement en laboratoire

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Stratégies d’échantillonnage et traitement des échantillons de tissu de la biobanque de modèles biomédicaux porcins

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Remote Laboratory Management: Respiratory Virus Diagnostics

An uptick in recent pandemics (Ebola, Zika, MERS, influenza, etc.) underlines the need for a more 'nimble,' coordinated response that addresses a multitude of issues ranging from transportation, access, facilities, equipment, and communication to provider training. To address this need, we have developed an innovative, scalable, logistics-enhanced, mobile, laboratory facility for emergencies and epidemics in resource-constrained global settings. Utilizing a background in clinical operations as an academic medical center, we designed a rapidly-deployable, modular BSL-2 and BSL-3 facility with user-friendly software for tracking and management of drugs and supplies in remote regions during epidemics and outbreaks. Here, we present our intermodal, mobile, expandable shipping-container laboratory units. The design of the laboratory facilitates off-grid usage by minimizing power consumption and allowing alternate water sources. The unit's information communication technology (ICT) platform provides (i) user-friendly tablet-based documentation, (ii) enhanced tracking of patients and supplies, and (iii) integrated communication onsite with built-in telehealth capabilities. To ensure quality in remote environments, we have developed a checklist for a basic laboratory workflow and a protocol for respiratory viral diagnosis using reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). As described, this innovative and comprehensive approach allows for the provision of laboratory capability in resource-limited global environments.

A rapidly-deployable, off-grid laboratory has been designed and built for remote, resource-constrained global settings. The features and critical aspects of the logistically-enhanced, expandable, multifunctional laboratory modules are explored. A checklist for a basic laboratory workflow and a protocol for a respiratory viral diagnostic test are developed and presented.

Laboratoire Remote Management : Diagnostics Virus respiratoire

An uptick in recent pandemics (Ebola, Zika, MERS, influenza, etc.) underlines the need for a more 'nimble,' coordinated response that addresses a ...

Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) activity and restoration from small molecule compounds. Our group recently focused on establishing a well-differentiated organoid model directly derived from primary human nasal epithelial cells (HNE). Histology of sectioned organoids, whole-mount immunofluorescent staining, and imaging (using confocal microscopy, immunofluorescent microscopy, and bright field) are essential to characterize organoids and confirm epithelial differentiation in preparation for functional assays. Furthermore, HNE organoids produce lumens of varying sizes that correlate with CFTR activity, distinguishing between CF and non-CF organoids. In this manuscript, the methodology for culturing HNE organoids are described in detail, focusing on the assessment of differentiation using the imaging modalities, including the measurement of baseline lumen area (a method of CFTR activity measurement in organoids that any laboratory with a microscope can employ) as well as the developed automated approach to a functional assay (which requires more specialized equipment).

A detailed protocol is presented here to describe an in vitro organoid model from human nasal epithelial cells. The protocol has options for measurements requiring standard laboratory equipment, with additional possibilities for specialized equipment and software.

Culture et imagerie des organoïdes épithéliaux nasaux humains

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary dyskinesia. However, the wider application of these techniques is limited by the extreme susceptibility of ciliary function to changes in environmental factors e.g., temperature, humidity, and pH. In the airway of patients with Cystic Fibrosis (CF), mucus accumulation impedes cilia beating. Cilia function has been investigated in primary airway cell models as an indicator of CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR) channel activity. However, considerable patient-to-patient variability in cilia beating frequency has been found in response to CFTR-modulating drugs, even for patients with the same CFTR mutations. Furthermore, the impact of dysfunctional CFTR-regulated chloride secretion on ciliary function is poorly understood. There is currently no comprehensive protocol demonstrating sample preparation of in vitro airway models, image acquisition, and analysis of Cilia Beat Frequency (CBF). Standardized culture conditions and image acquisition performed in an environmentally controlled condition would enable consistent, reproducible quantification of CBF between individuals and in response to CFTR-modulating drugs. This protocol describes the quantification of CBF in three different airway epithelial cell model systems: 1) native epithelial sheets, 2) air-liquid interface models imaged on permeable support inserts, and 3) extracellular matrix-embedded three-dimensional organoids. The latter two replicate in vivo lung physiology, with beating cilia and production of mucus. The ciliary function is captured using a high-speed video camera in an environment-controlled chamber. Custom-built scripts are used for the analysis of CBF. Translation of CBF measurements to the clinic is envisioned to be an important clinical tool for predicting response to CFTR-modulating drugs on a per-patient basis.

This protocol describes nasal epithelial cell collection, expansion, and differentiation to organotypic airway epithelial cell models and quantification of cilia beat frequency via live-cell imaging and custom-built scripts.

Collecte, expansion et différenciation de modèles de cellules épithéliales nasales nasales humaines primaires pour la quantification de la fréquence des battements de cils

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary ...

A Traditional Chinese Medicine Characteristic Therapy for Bronchial Asthma: Moxibustion

Bronchial asthma is a chronic inflammatory disease of the airway which can lead to symptoms such as recurrent wheezing, shortness of breath, chest tightness, or cough, as a result of increased airway reactivity. With high diurnal variation, these symptoms often occur or worsen at night or in the morning. By burning and roasting the Chinese medica above human acupoints, moxibustion is a type of treatment that stimulates the activity of the human meridians through drugs and heat stimulation to prevent and treat diseases. According to the principle of syndrome differentiation and treatment of traditional Chinese medicine, acupoints are selected on the corresponding parts, which has a definite effect. It is regarded as a characteristic traditional Chinese medicine therapy for bronchial asthma. This protocol elaborates the methods and steps of patient management, material preparation, selection of acupoints, operation, and postoperative nursing to ensure safe and effective moxibustion treatment to significantly improve the clinical symptoms and quality of life of patients with bronchial asthma.

This protocol presents a curative procedure of moxibustion in treating patients with bronchial asthma.

Une thérapie caractéristique de la médecine traditionnelle chinoise pour l’asthme bronchique : la moxibustion

Bronchial asthma is a chronic inflammatory disease of the airway which can lead to symptoms such as recurrent wheezing, shortness of breath, chest ...

Capture d’échantillons de tissus de fibrose sous-muqueuse buccale pour l’analyse spatio-omique

Isolation of Cells with Morphological and Spatial Information from Oral Submucous Fibrosis Samples by Laser Capture Microdissection

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina propria and the submucosa are often found on histopathological slides. Epithelial dysplasia, epithelial atrophy, and senescent fibroblasts have been proposed to be associated with the malignant transformation of OSF. However, because of the heterogeneity of potentially malignant oral disorders and oral squamous cell carcinoma, it is difficult to identify the specific molecular mechanisms of malignant transformation in OSF. Here, we present a method to obtain a small number of epithelial or mesenchymal cells carrying morphological data and spatial information by laser capture microdissection on formalin-fixed paraffin-embedded tissue slides. Using a microscope, we can precisely capture microscale (~500 cells) dysplastic or atrophic epithelial tissue and fibrotic subepithelial tissue. The extracted cells can be evaluated by genome or transcriptome sequencing to acquire genomic and transcriptomic data with morphological and spatial information. This approach removes the heterogeneity of bulk OSF tissue sequencing and the interference caused by cells in non-lesioned areas, allowing for precise spatial-omics analysis of OSF tissue.

Pleins feux sur l’auteur : Percer les mystères des tumeurs malignes potentielles buccales 

Laser capture microdissection of oral submucous fibrosis tissues allows for precise extraction of cells from histological regions of interest for the analysis of multi-omics data with morphological and spatial information.

Isolement de cellules avec des informations morphologiques et spatiales à partir d’échantillons de fibrose sous-muqueuse buccale par microdissection par capture laser

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina ...