Cette recherche peut aider à répondre à toutes les questions dans le domaine du nombre de biochimies et de la méthodologie, telles qu’une analyse des droits de développement dans le nématode. Le principal avantage de cette technique est la précipitation protéique dans l’extraduction et la boisson et l’homogénéisation des vers. Commencez cette expérience en cultivant la souche E.coli OP50 dans 300 millilitres de bouillon LB liquide moyen à 37 degrés Celsius pendant la nuit.
Magasiner avec succès OP50 à quatre degrés Celsius. Pipette deux millilitres de l’OP50 cultivé sur au moins trois NGM précédemment préparés, ou plaques d’agar nematode growth media et étalées à la main tourbillonnant la plaque. Incuber les plaques à température ambiante pendant la nuit pour créer une fine couche d’OP50.
Ensuite, utilisez un cure-dent stérile pour choisir un morceau d’agar dans une assiette avec des vers, pour ajouter au moins 100 vers à chaque plaque OP50 NGM. Culture au moins trois plaques avec les vers à 20 degrés Celsius, jusqu’à ce que les vers atteignent le stade adulte, ce qui est confirmé au microscope stéréoscopique. Localiser les hermaphrodites gravid remplies d’œufs à l’aide d’un microscope stéréoscopique.
Après avoir ajouté cinq millilitres de tampon S aux plaques, utilisez la pipette Pasteur pour transférer les vers des trois plaques à un tube conique de 15 millilitres. Lavez les vers trois fois en ajoutant 15 millilitres de tampon S, puis en centrifugant à 300 fois G à température ambiante pendant 30 secondes. Si le volume du tampon S dépasse cinq millilitres, retirez l’excédent de tampon après centrifugage.
Pour une exonisation réussie et l’isolement des œufs en vrac, dissoudre les vers en 0,5 millilitres de solution hypo chlorate alcaline. Mélanger en inversant et en incubant à température ambiante pendant 10 à 15 minutes. Centrifugeuse à 1400 RPM pendant 30 secondes pour enlever la solution.
Utilisez 15 millilitres de tampon S pour laver la pastille d’œuf. Après l’avoir centrifugé, retirez le supernatant et répétez ce lavage au moins trois fois. Après le dernier lavage, nous suspendons la pastille en cinq à six millilitres de tampon S, sans E.coli et incubons les œufs pendant la nuit à 20 degrés Celsius pour les éclore et atteindre la culture synchrone H des larves de stade L1.
Pipette 10 microlitres de S-tampon contenant des vers L1 sur trois feuillets de couverture. Comptez les larves au microscope stéréoscopique et calculez la moyenne pour déterminer le nombre approximatif de larves de stade L1. Enfin, transférez les larves de stade L1 dans cinq plaques d’agar NGM avec OP50 et cultivez-les à 20 degrés Celsius jusqu’au stade du jeune adulte, au cours duquel l’autoftilisation se produit et où quelques œufs sont pondus.
Observez les vers tous les jours au microscope, puis recueillez les jeunes adultes, ou les vers de cinq jours. Pour sélectionner uniquement les vers vivants, ajoutez les vers suspendus en trois à quatre millilitres de tampon S à un tube conique de 15 millilitres. Ajouter ensuite un volume égal de saccharose glacé à 60 % et mélanger.
Centrifugeuse le tube à 1500 fois G à quatre degrés Celsius pendant 15 secondes. Ensuite, utilisez une pipette Pasteur pour déplacer soigneusement les vers du mur du tube, puis retirez les vers flottants dans un tube frais. Remplissez le tube de S-tampon pour laver les vers, et centrifugeuse à 1500 fois G à quatre degrés Celsius pendant 30 secondes.
Retirez le tampon et répétez le lavage deux fois de plus. Après le troisième lavage, retirez soigneusement le supernatant, en vous assurant de ne pas enlever les vers, et utilisez une pointe de pipette de 1000 microlitres pour mesurer le volume humide des vers lavés. Pour les précipitations protéiques, utilisez une pipette Pasteur pour ajouter les vers lavés à un volume égal d’acide trichloroacetic glacé à 10 % dans un homogénéisateur placé sur la glace.
Homogénéiser à l’aide de 40 coups de passel avec rotation, jusqu’à 1300 RPM. Utilisez un homogénéiseur ultrasonique avec un cycle de 20% de service pour sonifier l’homogénéité. Utilisez une pipette Pasteur pour transférer l’homogénéate à un tube de 1,5 millilitre placé sur la glace.
Après avoir transféré l’homogénéité dans un tube de micro centrifugeuse, centrifugeuse à 8000 g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour le clarifier. Transférer le supernatant dans un tube frais et ajouter quatre molaire de chlorure de potassium et l’incuber sur la glace pendant 20 minutes pour le neutraliser. Puis centrifugez-le à 8000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Transférer le surnatant dans un tube frais et conserver à 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit nécessaire pour d’autres analyses. Pour mesurer la concentration de lactate, utilisez une trousse d’analyse colorimétrique pour effectuer des analyses en double pour les échantillons d’essai. Ajouter 10 microlitres des échantillons d’essai à chaque puits d’une plaque de 96 puits, puis ajouter un tampon d’essai de lactate à chaque échantillon pour ajuster le volume à 15 microlitres.
Diluer la norme L+Lactate de 100 millimlaires avec tampon d’essai de lactate à un millimolaire. Ensuite, dans une série de puits, ajouter zéro, deux, quatre, six, huit et 10 microlitres de L+Lactate Standard dilué. Ajouter 50 microlitres de mélange de réaction à chaque puits, et incuber à température ambiante à l’abri de la lumière pendant au moins 30 minutes pour que la couleur se développe.
Enfin, utilisez un lecteur de microplaque pour mesurer l’absorption de chaque puits à 570 nanomètres. Soustrayez l’absorption du mélange de contrôle de fond de l’absorption du mélange de réaction. Tracez ensuite la courbe standard de lactate et calculez les concentrations de lactate de la courbe en multipliant chaque concentration par 2,25.
Utilisez une trousse d’analyse colorimétrique pour mesurer la concentration de pyruvate dans les échantillons d’essai et effectuez des examens en duplex. Ajouter 10 microlitres des échantillons d’essai à différents puits d’une plaque de 96 puits et ajouter 90 microlitres de réaccentrage de travail à chaque échantillon. Incuber couvert pendant 30 minutes à température ambiante.
Placez ensuite la plaque dans le lecteur de microplaque pour mesurer l’absorption de chaque puits à 570 nanomètres. Tracez la courbe standard du pyruvate et calculez les concentrations de pyruvate de la courbe standard en multipliant chaque concentration par 2,25. Enfin, pour mesurer la concentration de protéines dans les échantillons d’essai, utilisez un kit d’analyse colorimétrique tel que décrit dans le protocole texte.
Après précipitation protéique, des analyses colorimétriques peuvent être utilisées pour la détermination quantitative des concentrations de lactate et de pyruvate. Cette expérience montre l’exactitude des analyses colorimétriques contrairement aux rapports précédents dans C.Elegans. En outre, ces analyses sont suffisamment sensibles pour mesurer les concentrations de lactate et de pyruvate, même dans les échantillons à petite échelle dans un court laps de temps.
Pour détecter avec précision le lactate et le pyruvate chez C.elegans, il est crucial d’effectuer des précipitations protéiques lors de l’homogénéisation des vers. La quantité de lactate et de pyruvate détectée est plus élevée lorsque les échantillons sont précipités par protéine pendant l’homogénéisation, comparativement à une fraction cytosolique intacte ou après homogénéisation lorsqu’aucun lactate ou pyruvate n’a été détecté.
