Bu araştırma, nematod gelişim haklarının analizi gibi biyokimya sayımı ve metodoloji alanındaki tüm soruların yanıtlatına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı ekstradüksiyon ve içecek protein çökeltme ve solucanların homojenizasyonudur. Bu deneye, bir gecede 37 santigrat derecede 300 mililitre LB suyu sıvı ortasında E.coli OP50 suşunu büyüterek başlayın.
Başarılı OP50'yi dört santigrat derecede saklayın. Pipet en az üç önceden hazırlanmış NGM, veya Nematode Büyüme Medya Agar Plakalar kültürlü OP50 iki mililitre ve elle plaka girdap yayıldı. OP50 ince bir tabaka oluşturmak için bir gecede oda sıcaklığında plakalar kuluçka.
Daha sonra, her OP50 NGM plaka en az 100 solucan eklemek için, solucanlar ile bir tabak agar bir parça almak için steril bir kürdan kullanın. Kültür solucanlar 20 santigrat derecede solucanlarla en az üç tabak, ta ki solucanlar stereoskopik mikroskop altında doğrulanan yetişkin aşamasına ulaşana kadar. Stereoskopik mikroskop kullanarak yumurta dolu gravid hermafroditler bulun.
Plakalara beş mililitre S-tampon ekledikten sonra, solucanları her üç plakadan 15 mililitrekonik tüpe aktarmak için Pasteur pipetini kullanın. Solucanları 15 mililitre S-tampon ekleyerek ve 30 saniye oda sıcaklığında 300 kez G'de santrifüj ederek üç kez yıkayın. S-arabelleği hacmi beş mililitreyi aşarsa, santrifüjden sonra fazla arabelleği çıkarın.
Başarılı eksonizasyon ve dökme yumurta izolasyonu için solucanları 0,5 mililitre alkalin hipo klorat çözeltisi içinde çözün. 10-15 dakika oda sıcaklığında ters çevirerek ve kuluçka ile karıştırın. Çözümü çıkarmak için 30 saniye boyunca 1, 400 RPM'de santrifüj.
Yumurta pelet yıkamak için S-tampon 15 mililitre kullanın. Santrifüj den sonra supernatant çıkarın ve en az üç kez bu yıkama tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, peleti 5-6 mililitre S-tampon uzerine askıya alıyoruz, E.coli olmadan ve yumurtaları bir gecede 20 santigrat derecede kuluçkaya yatırıp yumurtaları yumurtadan çıkarıyoruz ve L1 sahne larvalarının H senkron kültürünü elde ediyoruz.
Pipet 10 mikrolitre S-tampon içeren L1 solucanları üç kapak fişinde. Stereoskopik mikroskop altında larvaları sayın ve yaklaşık L1 evre larvalarının sayısını belirlemek için ortalamayı hesaplayın. Son olarak, Op50 ile beş NGM Agar Plakaları L1 sahne larvaları aktarın ve genç yetişkin aşamasına kadar 20 santigrat derece onları büyümek, sırasında kendi kendine döllenme oluşur ve birkaç yumurta yatırılır.
Her gün mikroskop altında solucanlar gözlemlemek ve daha sonra genç yetişkin, ya da beş günlük solucanlar toplamak. Sadece yaşayan solucanları seçmek için, 3-4 mililitre S-tamponunda asılı olan solucanları 15 mililitrelik konik bir tüpe ekleyin. Sonra buz gibi eşit hacimli ekleyin 60% sakaroz ve karıştırın.
Tüpü 15 saniye boyunca 4 santigrat derecede 1, 500 kez G'de santrifüj edin. Sonra dikkatle tüp duvarından solucanlar taşımak için bir Pasteur pipet kullanın ve sonra taze bir tüp içine yüzen solucanlar kaldırın. Solucanları yıkamak için tüpü S-tamponile doldurun ve 30 saniye boyunca 4 santigrat derecede 1500 kez G'de santrifüj yapın.
Arabelleği çıkarın ve yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Üçüncü yıkamadan sonra, herhangi bir solucan ıstırmama emin olmak için, supernatant çıkarın ve yıkanmış solucanların ıslak hacmini ölçmek için 1.000 mikrolitrelik pipet ucu kullanın. Protein yağışı için, yıkanmış solucanları buz üzerine yerleştirilen bir homogenizer %10 trikloroasetik asit hacmine eşit hacimde eklemek için pasteur pipeti kullanın.
1, 300 RPM'ye kadar dönüşlü 40 pasel darbesi kullanarak homojenleştirin. Homojen sonicate% 20 görev döngüsü ile bir ultrasonik homogenizer kullanın. Homojeni buz üzerine yerleştirilen 1,5 mililitrelik tüpe aktarmak için pasteur pipetkullanın.
Bir mikro santrifüj tüpü için homojen transfer sonra, santrifüj 8, 000 zaman G dört derece santigrat 10 dakika açıklığa kavuşturmak için. Supernatant'ı taze bir tüpe aktarın ve nötralize etmek için dört azı lı potasyum klorür ekleyin ve 20 dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yatırın. Sonra 8,000 kez G'de 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin.
Supernatant'ı taze bir tüpe aktarın ve daha fazla tahlil için gerekli olana kadar 80 santigrat derecede saklayın. Laktat konsantrasyonu ölçmek için, test örnekleri için yinelenen analizler yürütmek için bir kolorimetrik test kiti kullanın. 96 kuyulu bir plakanın her kuyuya test numunelerinden 10 mikrolitre ekleyin ve sonra ses seviyesini 15 mikrolitreye ayarlamak için her numuneye laktat test arabelleği ekleyin.
Seyreltik 100 milimolar L + Laktat Standart laktat tsay tampon ile bir milimolar. Sonra, kuyubir dizi içine, sıfır, iki, dört, altı, sekiz ve seyreltilmiş L + Laktat Standart 10 mikrolitre ekleyin. Her kuyuya 50 mikrolitre reaksiyon karışımı ekleyin ve rengin gelişmesi için ışıktan en az 30 dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
Son olarak, 570 nanometre de her kuyunun emiciliğini ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın. Reaksiyon karışımının emiciliğinden arka plan kontrol karışımının emiciliğini çıkarın. Daha sonra laktat standart eğrisini çizin ve her konsantrasyonu 2,25 ile çarparak eğriden laktat konsantrasyonlarını hesaplayın.
Test numunelerinde pirüvat konsantrasyonu ölçmek ve çift yönlü incelemeler yapmak için kolorimetrik bir test kiti kullanın. 96 kuyulu bir plakanın farklı kuyularına test numunelerinden 10 mikrolitre ekleyin ve her numuneye 90 mikrolitre çalışma reaktifi ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübasyon.
Sonra 570 nanometre her kuyunun emiciliğini ölçmek için mikroplaka okuyucu plaka yerleştirin. Pirüvat standart eğrisini çizin ve her konsantrasyonu 2,25 ile çarparak standart eğriden pirüuvat konsantrasyonlarını hesaplayın. Ve son olarak, test örneklerindeki protein konsantrasyonu ölçmek için metin protokolünde açıklandığı gibi kolorimetrik bir test kiti kullanın.
Protein çökeltmesinden sonra laktat ve pirüvat konsantrasyonlarının kantitatif tayini için kolorimetrik tahliller kullanılabilir. Bu deney, C.Elegans'taki önceki raporlara aykırı olarak kolorimetrik tahlillerin doğruluğunu göstermektedir. Ayrıca, bu tahliller kısa bir süre içinde küçük ölçekli numunelerde bile laktat ve pirüvat konsantrasyonlarını ölçmek için yeterince duyarlıdır.
C.elegans laktat ve pirüvat doğru tespit etmek için, solucanların homojenizasyonu sırasında protein çökeltme gerçekleştirmek için çok önemlidir. Tespit edilen laktat ve pirüuvat miktarı, homojenizasyon sırasında proteinlerin protein olarak çöktürüldüğünde, bozulmamış sitosolik fraksiyona göre veya homojenizasyondan sonra laktat veya pirüuvat saptanmadığunda daha yüksektir.
