מחקר זה יכול לעזור לענות על כל שאלה בהם ספירת ביוכימיה ותחום המתודולוגיה כגון ניתוח של זכויות פיתוח nematode. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא משקעים בחלבון בהסגרה ושתייה והומוגניזציה של התולעים. התחל ניסוי זה על ידי גידול זן E.coli OP50 ב 300 מיליליטר של מדיום נוזלי מרק LB ב 37 מעלות צלזיוס לילה.
אחסן OP50 מוצלח בארבע מעלות צלזיוס. פיפטה שני מיליליטר של OP50 מתורבת על מינימום שלושה NGM שהוכן בעבר, או Nematode צמיחה מדיה אגר צלחות להתפשט ביד מערבל את הצלחת. הדגירה את הצלחות בטמפרטורת החדר לילה כדי ליצור שכבה דקה של OP50.
לאחר מכן, השתמש בקיסם סטרילי כדי לבחור חתיכת אגר מצלחת עם תולעים, כדי להוסיף לפחות 100 תולעים לכל צלחת OP50 NGM. תרבות לפחות שלוש צלחות עם התולעים ב 20 מעלות צלזיוס, עד התולעים להגיע לשלב למבוגרים, אשר אושר תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. אתר הרמפרודיטים gravid מלא ביצים באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי.
לאחר הוספת חמישה מיליליטר של S-buffer לצלחות, להשתמש פיפטה פסטר להעביר את התולעים מכל שלוש הצלחות לצינור חרוט 15 מיליליטר. לשטוף את התולעים שלוש פעמים על ידי הוספת 15 מיליליטר של S-buffer ולאחר מכן צנטריפוגה ב 300 פעמים G בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות. אם אמצעי האחסון של S-buffer חורג מחמישה מיליליטר, הסר את המאגר העודף לאחר הצנטריפוגה.
לזיכוי מוצלח ובידוד ביצים בתפזורת, ממיסים את התולעים ב-0.5 מיליליטר של תמיסת היפו כלורט אלקליין. מערבבים על ידי היפוך ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 15 דקות. צנטריפוגה ב 1, 400 סל"ד במשך 30 שניות כדי להסיר את הפתרון.
השתמש 15 מיליליטר של S-חיץ לשטוף את גלולת הביצה. לאחר צנטריפוגה זה להסיר את supernatant ולחזור על זה לשטוף לפחות שלוש פעמים. לאחר הכביסה האחרונה, אנו להשעות את גלולה בחמישה עד שישה מיליליטר של S-buffer, ללא E.coli ו דגירה הביצים לילה ב 20 מעלות צלזיוס לבקוע אותם ולהשיג תרבות סינכרונית H של זחלי שלב L1.
פיפטה 10 מיקרוליטרים של S-buffer המכיל תולעי L1 על שלוש תלושי כיסוי. ספור את הזחלים תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי וחשב את הממוצע כדי לקבוע את המספר המשוער של זחלי שלב L1. לבסוף, להעביר את הזחלים שלב L1 לחמישה צלחות אגר NGM עם OP50 ולגדל אותם ב 20 מעלות צלזיוס עד השלב הצעיר למבוגרים, שבמהלכו הפריה עצמית מתרחשת וכמה ביצים מונחות.
שימו לב לתולעים כל יום מתחת למיקרוסקופ ואז אספו את הצעירים, או תולעים בני חמישה ימים. כדי לבחור רק תולעים חיות, הוסף את התולעים התלויות בשלושה עד ארבעה מיליליטר של S-buffer לצינור חרוט 15 מיליליטר. לאחר מכן מוסיפים נפח שווה של 60% סוכרוז קר כקרח ומערבבים.
צנטריפוגה הצינור ב 1, 500 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 שניות. לאחר מכן השתמש פיפטה פסטר בזהירות להזיז את התולעים מקיר הצינור, ולאחר מכן להסיר את התולעים הצפות לתוך צינור טרי. ממלאים את הצינור ב- S-buffer כדי לשטוף את התולעים, וצנטריפוגה ב 1500 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 שניות.
הסר את המאגר וחזור על שטיפה פעמיים נוספות. לאחר הכביסה השלישית, הסר בזהירות את העל-טבעי, הקפד לא להסיר תולעים, ולהשתמש בקצה פיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי למדוד את הנפח הרטוב של התולעים השטופות. למשקעי חלבון, השתמשו בפיפיאט פסטר כדי להוסיף את התולעים השטופות לנפח שווה של חומצה קריכלורואצטית קרה כקרח של 10% בהומוגניזציה המונחת על קרח.
הומוגניזציה באמצעות 40 משיכות פסאל עם סיבוב, עד 1, 300 סל"ד. השתמש homogenizer קולי עם 20% מחזור החובה כדי sonicate הומוגנית. השתמש פיפטה פסטר להעביר את הומוגנטי ל 1.5 צינור מיליליטר להציב על קרח.
לאחר העברת homogenate לצינור מיקרו צנטריפוגה, צנטריפוגה ב 8, 000 זמן G בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להבהיר את זה. מעבירים את העל-טבעי לצינור טרי ומוסיפים ארבעה אשלגן כלורי טוחן ודגירה על קרח במשך 20 דקות כדי לנטרל אותו. ואז צנטריפוגה זה ב 8, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
מעבירים את העל-טבעי לצינור טרי ומאחסנים ב-80 מעלות צלזיוס עד לצורך בבדיקות נוספות. כדי למדוד את ריכוז הלקטאט, השתמש בערכת בדיקה צבעונית כדי לבצע ניתוחים כפולים עבור דגימות הבדיקה. הוסיפו 10 מיקרוליטרים של דגימות הבדיקה לכל באר של צלחת של 96 בארות, ולאחר מכן הוסיפו מאגר בדיקת לקטט לכל דגימה כדי להתאים את עוצמת הקול ל-15 מיקרוליטרים.
לדלל 100 מילימולר L + לקטט רגיל עם מאגר מיסי לקטט למילימולר אחד. לאחר מכן, לתוך סדרה של בארות, להוסיף אפס, שתיים, ארבע, שש, שמונה, ו 10 microliters של תקן L + לקטט מדולל. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של תערובת תגובה לכל באר, ו דגירה בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור לפחות 30 דקות להתפתחות הצבע.
לבסוף, השתמש בקורא מיקרופלסטיק כדי למדוד את הספיגה של כל באר ב 570 ננומטר. הפחת את הספיגה של תערובת בקרת הרקע מהספיגה של תערובת התגובה. לאחר מכן להתוות את העקומה הסטנדרטית לקטט, ולחשב את ריכוזי לקטט מן העקומה על ידי הכפלת כל ריכוז על ידי 2.25.
השתמש בערכת בדיקה צבעונית כדי למדוד את ריכוז הפירובט בדגימות הבדיקה, ולבצע בדיקות דופלקס. הוסף 10 microliters של דגימות הבדיקה בארות שונות של צלחת 96 באר, ולהוסיף 90 microliters של reagent עובד לכל מדגם. הדגירה מכוסה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן מניחים את הצלחת אצל קורא המיקרופלסטיק כדי למדוד את הספיגה של כל באר ב-570 ננומטר. להתוות את העקומה הסטנדרטית פירובט, ולחשב את ריכוזי פירובט מן העקומה הסטנדרטית על ידי הכפלת כל ריכוז על ידי 2.25. ולבסוף, כדי למדוד את ריכוז החלבון בדגימות הבדיקה, השתמש בערכת בדיקה צבעונית כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
לאחר משקעים חלבון, בדיקות colorimetric יכול לשמש לקביעה כמותית של ריכוזי לקטט פירובט. ניסוי זה מראה את הדיוק של אסיונות צבעוניים בניגוד לדיווחים קודמים ב- C.Elegans. יתר על כן, אלה assays רגישים מספיק כדי למדוד ריכוזי לקטט פירובט אפילו בדגימות בקנה מידה קטן בתקופה קצרה של זמן.
כדי לזהות במדויק לקטט ופירובט ב C.elegans, חיוני לבצע משקעים חלבון במהלך הומוגניזציה של התולעים. כמות הלקטאט והפירומט שזוהו גבוהה יותר כאשר דגימות הן חלבון זירז במהלך הומוגניזציה, לעומת שבר ציטוסולי שלם או לאחר הומוגניזציה כאשר לא זוהה לקטט או פירובט בכלל.
