Cette méthode fournit un outil important dans le domaine de la modification des protéines, permettant la génération facile et efficace de conjugués anticorps. Les principaux avantages de cette technique sont la facilité de manipulation, le rendement élevé de la production d’anticorps, la vitesse de la réaction de psychodision, et la stabilité du lien formé. Commencez cette procédure avec la croissance des cellules de suspension HEK tel que décrit dans le protocole de texte.
Lorsque la densité de 2,5 millions de cellules par millilitre est atteinte, préparez une nouvelle solution du dérivé cyclopropène de la lysine, ou CpK, en hydroxyde de sodium 1 molaire. Ajouter 2,5 millilitres de CpK à l’expression moyenne complétée par des antibiotiques. Bien mélanger la solution et ajouter 250 microlitres d’un HCl molaire, puis stériliser la solution à l’aide d’un filtre de 22 microns.
Centrifugeuse maintenant 125 millions de cellules à la densité cible pendant cinq minutes à 500 x g. Après centrifugation, ajouter le mélange réaménageur ADN-transfection au milieu d’expression contenant cpk et utiliser ce milieu pour résuspendre les cellules. Six à sept jours après l’ajout de CpK, récolter le trastuzumab portant des anticorps CpK du supernatant en centrifugant les cellules pendant 15 minutes à 3000 x g.
Ensuite, filtrer le surnatant. Maintenant, ajoutez 5x tampon de lavage de perles dans des tubes coniques de 250 millilitres et mélanger avec le supernatant et ajouter la résine prééquilibrée protéine A. Placez le tube conique sur un rouleau pendant trois heures à température ambiante pour tirer vers le bas l’anticorps et le supernatant.
Après l’incubation, transférer la résine protéine A avec le supernatant dans une colonne et laisser passer le liquide. Ajouter ensuite 25 millilitres de tampon de lavage et laisser passer. Ajouter un millilitre d’un tampon de phosphate molaire, du chlorure de sodium de 150 millimlaires au tube de collecte et élitiser l’anticorps avec quatre millilitres de 1 pH de citrate de sodium molaire 3.
La solution acide est immédiatement neutralisée au fur et à mesure qu’elle sort de la colonne par la solution de base déjà présente dans le tube de collecte. Ensuite, diluer l’anticorps avec 10 millilitres de PBS. Concentrez l’anticorps à 5 à un millilitre par filtration centrifuge et échangez le tampon trois fois avec PBS.
Purifier les échantillons par FPLC à l’aide d’une colonne d’interaction hydrophobe de butyl avec zéro à 100% gradient de tampon de faible teneur en sel dans le tampon de sel élevé plus de 30 minutes. Recueillir toutes les fractions et surveiller l’élitution à 280 nanomètres. Concentrez les fractions qui contiennent des anticorps par filtration centrifuge et échangez le tampon trois fois avec PBS.
L’anticorps peut alors être stocké à quatre degrés Celsius. Monomethyl auristatin E, ou MMAE, est très toxique. Par conséquent, utilisez des gants et des lunettes lorsque vous manipulez des dérivés MMAE.
Si vous utilisez mmae non modifié comme un contrôle, manipuler le produit solide à l’intérieur d’un capot de fumée lors de la préparation de la solution de stock dans l’OSM. Pour conjuguer l’anticorps avec la molécule porteuse de tétrazine, diluer 10 équivalence molaire de tétrazine MMAE par anticorps avec 20 microlitres d’acétyltrile et 76 microlitres de PBS dans un petit tube conique. Ajouter un équivalent molaire de trastuzumab portant CPK.
Bien mélanger et laisser réagir pendant trois heures à température ambiante pour former du trastuzumab lié au MMAE. Des molécules autres que le MMAE potentiellement plus grandes et plus entravées de façon plus stérile peuvent être reliées à l’anticorps à l’aide de ce protocole. Ajouter tout le volume de la réaction sur la colonne de spin et la centrifugeuse à 1500 x g pendant une minute.
Pour analyser le conjugué, équilibrer la colonne HPLC HIC avec un tampon de sel 100% élevé pendant cinq minutes. Mélangez ensuite 15 microlitres d’une solution millimétrique par millilitre de trastuzumab reliée au MMAE avec 15 microlitres de tampon de sel de 2 X de haut dans un flacon. Injecter le mélange sur la colonne HPLC.
Elute dans un débit isocratique d’un millilitre par minute avec tampon de sel 100% élevé pendant une minute. Suivez ceci avec un gradient de 15 minutes de 100 à zéro pour cent de tampon de sel élevé dans le tampon de sel bas. Surveillez l’élitution à 280 nanomètres.
Intégrer les pics sur le chromatogramme avec des temps de rétention de 7,5, 9,2 et 11,5 minutes, qui correspondent au trastuzumab avec zéro, une et deux toxines conjuguées, respectivement. Maintenant, calculer le DAR en additionnant les zones des pics à 9,2 minutes, qui a un poids d’un, et 10,5 minutes, qui a un poids de deux, et diviser par la superficie totale des trois pics. Analyser le conjugué par LC-MS, tout d’abord, déglycosylate 30 microlitres d’un milligramme par millilitre ADC et l’anticorps non modifié dans des conditions non réductrices en utilisant 250 unités de PNGase F pendant au moins six heures à 37 degrés Celsius.
Décongeler le sérum et le filtrer à travers un filtre de 22 microns. Remplissez ensuite les puits externes d’une plaque de puits de 96 avec de l’eau. Dans les puits centraux, mélanger en triplicate 90 microlitres de sérum avec 10 microlitres d’un milligramme par millilitre trastuzumab tétramethylrhodamine dans PBS à une concentration finale de 1 milligramme par millilitre.
Placez la plaque dans un incubateur saturé d’humidité à 37 degrés Celsius et à 4 % de CO2. Toutes les 24 heures sur cinq jours, pipette chaque bien mélanger et prendre un aliquot cinq microlitres. Flash congeler l’aliquot avec de l’azote liquide et stocker à 80 degrés Celsius.
Une fois que tous les échantillons ont été prélevés, décongeler les aliquots et analyser à l’aide d’un ELISA indirect, tel que détaillé dans le protocole texte. Alternativement, un kit COMMERCIAL ELISA peut être utilisé pour mesurer la concentration de l’ADC. Deux jours avant l’essai, remplissez les puits extérieurs d’une plaque de puits de 96 avec de l’eau.
Puis soulever les cellules avec 05% trypsine en 5 millimolaire EDTA. Centrifugez les cellules trois minutes à 250 x g et résuspendez dans un nouveau milieu. Puis grainez 3000 cellules dans 100 microlitres par puits dans 96 plaques de puits et placez-les de nouveau dans l’incubateur.
Deux jours après l’ensemencement des cellules, préparer des dilutions en série de tous les échantillons en triplicate avec 1% DMSO dans le milieu complet. Maintenant, ajoutez 100 microlitres de chaque échantillon dans chaque puits et incubez pendant cinq jours à 37 degrés Celsius et quatre pour cent de CO2. Le cinquième jour, mesurez la viabilité de la cellule.
À cette fin, utilisez un kit commercial pour lyse les cellules et mesurer l’ATP libéré. Tracer le pourcentage de signal en ce qui concerne les cellules de contrôle traitées avec 1%DMSO. Les ADC peuvent être incubés à 37 degrés Celsius pendant cinq jours dans le sérum et analysés pour la cytotoxicité pour prouver la stabilité fonctionnelle.
Un anticorps avec une poignée de cyclopropène peut être obtenu en utilisant cette procédure avec des rendements supérieurs à 20 milligrammes par litre après la purification de la protéine A. L’anticorps produit peut être rapidement et spécifiquement conjugué à une toxine portant une tétrazine. Lors de la conjugaison de l’anticorps avec une toxine, les rapports moyen des médicaments par rapport aux anticorps sont supérieurs à 1,9, mesurés par chromatographie d’interaction hydrophobe.
L’identité de l’ADC est confirmée par spectrométrie de masse. Le lien dihydropyridizene généré est stable dans le sérum humain pendant plus de cinq jours à 37 degrés Celsius. Le conjugué anticorps est puissant et tue sélectivement les cellules avec des niveaux élevés de HER2, plutôt que les cellules avec de faibles niveaux de HER2.
En outre, l’anticorps sans la toxine et la toxine modifiée avec le linker tétrazine ont une toxicité très faible. La toxine à elle seule montre une toxicité non dépendante du HER2 soulignant la nécessité de cibler pour atteindre la sélectivité. Après cette procédure, nous pouvons préparer rapidement et efficacement les conjugués de drogue d’anticorps pour le traitement des tumeurs.
Potentiellement, n’importe quel médicament fonctionnalisé avec une tétrazine peut être lié à n’importe quel anticorps ciblant un biomarqueur de cellules cancéreuses. Les implications de cette technique s’étendent à n’importe quel conjugué de protéine destiné à la thérapie ou au diagnostic.
