Nous remercions le généreux soutien de plusieurs fondations et donateurs philanthropiques (voir SakmarLab.org).

Une. Incorporation génétique spécifique de site d&#39;acides aminés non naturels dans les RCPG <ol><li> Maintenir des cellules HEK293T dans du DMEM (4,5 g / L de glucose, de glutamine 2 mM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5%. </li><li> Transfecter les cellules cultivées à 60-80% de confluence dans une plaque de 10 cm en utilisant le réactif Lipofectamine Plus. <ol><li> 750 ul de DMEM, ajouter 10 ul de réactif Plus, 3,5 ug d&#39;ADNc de GPCR (pMT4. Rho ou pcDNA 3.1. CCR5) contenant le codon d&#39;arrêt ambre dans une position souhaitée, 3,5 ug d&#39;ARNt suppresseur ADNc (pSVB.Yam) et 0,35 pg ARNt synthétase mutante de l&#39;ADNc de l&#39;amino-acyl de p-azido-L-phénylalanine (pcDNA.RS). Incuber à température ambiante pendant 15 min. Également effectuer une transfection similaire en utilisant le poids GPCR ADNc (ne contenant pas de codon stop ambre) pour servir de contrôle. Ajouter ce mélange à 750 ul de DMEM avec 17 pi Lipofectamine. Après équilibration de 15 min à température ambiante, porter levolume total de 4 ml. </li><li> Aspirer le milieu sur plaque de 10 cm, appliquer le mélange de transfection à des cellules, et le retour à 37 ° C dans 5% de CO2 atmosphère. Après 4-6 heures, compléter cellules avec 4 ml de DMEM contenant 20% de FBS et 1 mM AZF. </li></ol></li><li> Le jour suivant, remplacer le milieu de croissance avec du milieu DMEM contenant 10% de FBS et 0,5 mM AZF. </li><li> Récupération des cellules 48 heures après la transfection, pour analyser l&#39;expression ou de procéder à des procédures de photoréticulation ou d&#39;étiquetage décrites dans les sections suivantes. <ol><li> Confirmer l&#39;expression du mutant ambre GPCR en présence de la SAU dans le milieu de croissance. Nous faisons cela par détection Western blot. Lyse du culot cellulaire dans 1% (p / v) de dodécyl-β-D-maltoside (DDM) dans 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 100 mM pendant 1 heure à 4 ° C. Centrifuger le lysat à 16 000 xg et résoudre le surnageant dans des conditions réductrices par SDS-PAGE. Transférer sur une membrane de PVDF et effectuer des analyses d&#39;immuno-empreinte pour détecter l&#39;expression du récepteur de pleine longueur à l&#39;aide ee 1D4 mAb (Cellule Nationale Culture Center), qui reconnaît un épitope d&#39;ingénierie à l&#39;extrémité C-terminale du récepteur. 31 </li></ol></li></ol> 2. Cartographie d&#39;un site de liaison de ligand Utilisation ciblée Photoréticulation <ol><li> 48 heures après la transfection, les médias d&#39;aspiration à partir de cellules et les remplacer par 4 ml 1x tampon phosphate salin (PBS). Revenir à 37 ° C pendant 15 min. </li><li> Remettre en suspension les cellules avec PBS 1x et transférer dans un tube Falcon. Centrifuger à 1500 rpm pendant 2 min pour sédimenter les cellules et aspirer le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans une solution saline tamponnée de Hank contenant 1x mM HEPES, pH 7,5, BSA à 0,2% et le ligand tritié à la concentration de saturation de liaison pour la longueur nécessaire de temps et de température pour assurer la formation du complexe récepteur-ligand 20. </li><li> Transférer la suspension cellulaire à une plaque à 24 puits ou à 96 puits pour la photoactivation de la AZF à 365 nm (par exemple, en utilisant une lampe UV-A) pendant 15 min à 4 ° C. Maintain la plaque sur de la glace afin d&#39;éviter le chauffage de l&#39;échantillon et de la lyse cellulaire. </li><li> Transférer les cellules à un tube Eppendorf, centrifugeuse pour sédimenter les cellules, éliminer le surnageant et procéder à l&#39;analyse. Les pastilles peuvent être stockées à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. </li><li> Remettre en suspension les culots cellulaires dans du tampon de lyse contenant 1% (p / v) DDM, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 et des inhibiteurs de protéase. Après 1 heure d&#39;incubation à 4 ° C, centrifuger le lysat cellulaire pendant 10 min à 16 000 xg, et transférer le surnageant dans un nouveau tube. </li><li> Ajouter 1D4 résine mAb-Sepharose 2B au surnageant et laisser incuber pendant une nuit à 4 ° C à immunopurifier l&#39;GPCR en utilisant l&#39;extrémité C-terminale mAb 1D4 épitope d&#39;ingénierie. Le lendemain, les billes laver plusieurs fois avec du tampon de lyse. Échantillons élue avec 1% de SDS à 37 ° C pendant 1 h sous agitation. </li><li> Transférer une partie de l&#39;éluant à un flacon contenant 15 ml de fluide de scintillation et de compter sur un compteur à scintillation bêta pour quantifier la quantité de liaison spécifique du ligand tritié aux erécepteur d&#39;e. </li><li> Résoudre le restant 1D4 mAb éluant purifié par électrophorèse sur gel standard. Nous utilisons un gel SDS-PAGE 4-12% puis transfert semi-sec sur une membrane de PVDF pour immunoblot. Nous incluons également une voie avec échelle de protéine standard pour guider approximation visuelle de poids moléculaire. <ol><li> Bloquer la membrane de PVDF avec 5% de lait dans du tampon TBS contenant 0,05% de Tween-20. Sonder la membrane afin de confirmer l&#39;expression des récepteurs de pleine longueur avec l&#39;AcM 1D4 suivi d&#39;un anticorps secondaire anti-IgG de souris conjugué à la HRP. </li><li> Traiter avec chimioluminescence amplifiée (ECL) de réactif et exposer la membrane à autoradiographie film visualiser les bandes. </li></ol></li><li> Couper la membrane avec une lame de rasoir pour séparer chaque voie échantillon, suivie d&#39;une découpe au niveau des marqueurs spécifiques de poids moléculaire. Transférer les segments de membrane dans des flacons contenant un liquide de scintillation. Quantifier la quantité de tritium dans chaque segment de membrane par comptage sur un compteur à scintillation bêta. </li><li> Identifier le positifune photo-détection avec le tritium à la masse moléculaire apparente égale à la somme de celle des GPCR et le ligand. </li></ol> 3. Ciblée épitope de l&#39;étiquetage et de surface cellulaire immuno-enzymatique (ELISA) <ol><li> 24 heures après la transfection, laver les cellules avec 1 ml de PBS 1x et trypsiniser avec 1 ml de 0,25% de trypsine pendant 3 min. Compléter avec 9 ml de DMEM contenant 10% de FBS et 0,5 mM AZF. Remettre les cellules et compter la densité cellulaire. Nous utilisons un hémocytomètre standard. </li><li> Pré-traiter, une plaque de 96 puits à fond transparent de haute liaison avec 100 ml de 0,01 mg / ml de poly-D-lysine par puits. Incuber pendant 30 min à température ambiante, laver à plusieurs reprises avec du PBS 1x et sécher à l&#39;air. </li><li> Plate 200 ul de cellules transfectées à une densité de 6 x 4 au 8 octobre x 10 4 cellules / puits à la plaque de 96 puits et retour à 37 ° C dans 5% de CO2 atmosphère. </li><li> Le lendemain, préparer des cellules pour l&#39;étiquetage. Lavez délicatement trois fois avec 100 pl / puits de PBS 1x to éliminer tout contenant un milieu de croissance AZF. S&#39;assurer cellules restent collées, par exemple, à l&#39;aide de PBS contenant Ca 2 + et Mg 2 +. </li><li> Préparer 50-200 pM FLAG-triarylphosphinique réactif de marquage en 1x HBSS / PBS d&#39;un stock maintenu à 5-20 mM dans du PBS. Appliquer 60 ml à chaque puits (en triple exemplaire pour chaque mutant ambre) et retour à 37 ° C pendant 30 min à 4 h. Maintenir un ensemble de puits sans traitement de l&#39;étiquette en 1x HBSS / PBS. Inclure aussi un contrôle de GPCR de poids à comparer avec des variantes AZF-GPCR. </li><li> Laver les cellules trois fois avec 100 pl / puits de tampon de blocage, BB (1 x PBS, 0,5% BSA), pour éliminer complètement l&#39;étiquette qui n&#39;a pas réagi. </li><li> Appliquer 100 pl / puits de paraformaldéhyde 4% (préparé à partir d&#39;un stock de 16% en 1x PBS) pour les cellules. Incuber pendant 20 min à température ambiante. Laver trois fois avec BB. </li><li> Exécuter le protocole de test ELISA de surface cellulaire standard pour détecter le récepteur marqué et l&#39;expression du récepteur. Incuber avec l&#39;anticorps primaire pendant 1,5 heure sur la glace suivie d&#39;un secondairetibody incubation à température ambiante pendant 1 heure. <ol><li> Ajouter 100 ul d&#39;anticorps anti-FLAG M2 (par exemple, dilution 1:2000 de l&#39;anticorps fabriqué en BB) pour détecter FLAG épitope peptidique du réactif de marquage FLAG-triarylphosphine. Sonder aussi non-étiquette puits traités comme contrôle négatif. Ajouter anti-CCR5 2D7 (nous utilisons une dilution 1:500) anticorps à un ensemble distinct de puits afin de déterminer en poids ou AZF-GPCR expression à la surface cellulaire. </li><li> Laver les cellules trois fois avec du BB, et incuber avec 100 pi d&#39;anticorps secondaire anti-IgG de souris conjugué à HRP (1:2000 dilution). </li><li> Laver soigneusement les cellules cinq fois avec BB. Ajouter 50 ul de tampon de détection: Amplex Red, 20 mM de H 2 O 2, 1x PBS (rapport 1:10:90) et incuber 15 min à température ambiante. Recueillir des données spectrales sur un lecteur de plaques multi-puits fluorescence à λ = 530 ex et λ em = 590. </li></ol></li></ol> 4. Bioorthogonal Marquage fluorescent d&#39;un GPCR <ol><li> Lyse10 7 cellules récoltées exprimant poids ou AZF-rhodopsine variantes dans 1 ml de tampon de solubilisation contenant 1% (p / v) de DM, HEPES 50 mM ou de Tris-HCl, pH 6,8, NaCl 100 mM, CaCl2 1 mM et des inhibiteurs de protéase pour une hr à 4 ° C. Centrifuger le lysat cellulaire à 15 000 xg pendant 10 minutes et recueillir la fraction de surnageant. </li><li> Ajouter 100 ul 1D4-mAb résine Sepharose 2B pour capturer récepteur utilisant le C-terminale 1D4 épitope ingénierie. Incuber pendant 12 heures à 4 ° C. Laver la résine à trois reprises avec 0,1% (p / v) DDM dans 0,1 M de tampon phosphate de sodium, pH 7,3. </li><li> Ajouter 0,1 mM fluorescéine-phosphine dans un volume total de 0,3 à 0,5 ml d&#39;étiqueter récepteur immobilisé sur la matrice d&#39;immuno-affinité (mAb 1D4-Sepharose 2B). Incuber pendant 12 heures à température ambiante. Centrifugeuse et enlever le surnageant. Laver la résine pour enlever l&#39;étiquette n&#39;a pas réagi. </li><li> Éluer le récepteur marqué avec 100 ml de tampon d&#39;élution contenant 0,1% (p / v) de DDM et 0,33 mg / ml nonapeptide (C9 peptide contre l&#39;épitope 1D4)dans un tampon phosphate 2 mM, pH 6,0 par incubation sur de la glace pendant 1 heure. </li><li> Résoudre les échantillons marqués par SDS-PAGE dans des conditions réductrices. Laver gels brièvement dans du PBS, puis visualiser l&#39;étiquetage des AZF-GPCR par fluorescence dans le gel. Par exemple, en utilisant un scanner à fluorescence confocal avec un laser de longueur d&#39;onde 488 nm pour détecter les récepteurs modifiés avec de la fluorescéine. </li></ol>

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S., MacKenzie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+rhodopsin:+characterization,+cross-reactivity,+and+application+as+structural+probes.">Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes.</a> Biochemistry. 22, 653-660 (1983).</li><li>Gether, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agonists+induce+conformational+changes+in+transmembrane+domains+III+and+VI+of+the+beta2+adrenoceptor.">Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor.</a> The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).</li><li>Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+structure,+dynamics,+and+activation:+A+perspective+from+crystallography,+site-directed+spin+labeling,+sulfhydryl+reactivity,+and+disulfide+cross-linking.">Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking.</a> Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).</li><li>Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+contact+sites+in+complex+formation+between+transducin+and+light-activated+rhodopsin+by+covalent+crosslinking:+use+of+a+photoactivatable+reagent.">Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).</li><li>Dorman, G., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzophenone+photophores+in+biochemistry.">Benzophenone photophores in biochemistry.</a> Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+the+site-specific+modification+of+proteins+in+vivo.">A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo.</a> Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).</li><li>Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophilic+catalysis+of+oxime+ligation.">Nucleophilic catalysis of oxime ligation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).</li><li>Yanagisawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistep+engineering+of+pyrrolysyl-tRNA+synthetase+to+genetically+encode+N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl)+lysine+for+site-specific+protein+modification.">Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification.</a> Chemistry &amp; biology. 15, 1187-1197 (2008).</li></ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Nous décrivons ici une méthode robuste pour incorporation spécifique du site d&#39;une sonde réactive, AZF, en RCPG et démontrons trois applications utiles de cet outil pour étudier la structure et la dynamique des RCPG. Notre méthode de site spécifiquement incorporer SAU contourne un problème fondamental d&#39;une stratégie alternative basée sur l&#39;étiquetage chimique 32, 33 ou 34 photoréticulants fixer à un seul mutant cystéine accessible. Bien que, chimies qui ciblent des group...

Heptahélice G récepteurs couplés aux protéines (RCPG) comprennent une superfamille de protéines de la membrane hautement dynamiques qui assurent la médiation des signaux extracellulaires importantes et variées. Dans le paradigme classique, l&#39;activation du récepteur est couplé à des changements de conformation induites par le ligand. 1, 2 Les récents progrès dans la biologie structurale des RCPG ont permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la signalisation transmembranaire. 3-5 Cependant, pour comprendre avec plus de précision chimique du mécanisme fonctionnel et dynamique des structures de signalisation des RCPG, une boîte à outils d&#39;approches sont nécessaires pour incorporer des sondes moléculaires et chimiques d&#39;information pour interroger des complexes de signalisation actifs. À cette fin, nous avons adapté une méthode de site spécifiquement introduire non ou minimalement sondes perturbateurs dans des récepteurs exprimés sur la base de contre nature acide aminé (SAU) de mutagenèse utilisant codon ambre technologie de suppression précédemment mis au point par Schultz et c. oworkers 6 Nous avons optimisé la méthode de mutagenèse SAU pour obtenir une expression à haut rendement et d&#39;un système de mutagenèse pour les protéines telles que les GPCR, qui sont difficiles à exprimer dans des systèmes hétérologues plus que d&#39;autres cellules de mammifères. L&#39;utilisation d&#39;un suppresseur orthogonal conçu ARNt et évolué aminoacyl-ARNt synthétase pour une SAU spécifique, nous place spécifiquement introduit SAU dans RCPG cibles exprimées. L&#39;incorporation réussie de SAU, la p-acétyl-L-phénylalanine (ACF), p-benzoyl-L-phénylalanine (BZF), et le p-azido-L-phénylalanine (AZF) a été démontrée dans les RCPG modèle - rhodopsine humaine et le récepteur de la chimiokine CC, CCR5. 7, 8 En principe, une SAU peut être génétiquement encodés à n&#39;importe quelle position dans la séquence de la protéine et cette propriété est un outil biochimique inestimable, car elle permet de numériser un seul codon d&#39;un GPCR cible. Nous nous concentrons ici spécifiquement sur la polyvalence de la SAU, AZF, qui a un azi réactivefaire partie. En plus de servir en tant que l&#39;infrarouge (IR) sonde unique, 8, 9 AZF peut aussi servir comme un agent de réticulation photo-activable par réaction avec des amines primaires aliphatiques voisins ou des atomes d&#39;hydrogène. En outre, le groupe azido biologiquement inerte peut participer en tant que poignée chimique sélective en réactions de marquage bioorthogonal. Ici, nous présentons des exemples illustrant les applications utiles de l&#39;incorporation spécifique du site de l&#39;usine AZF en GPCR, comme photoréticulation ciblées pour piéger un complexe récepteur-ligand, et la modification des RCPG par bioorthogonal marquage d&#39;épitope et les stratégies de marquage fluorescent. Des réactifs photo-activables ont été utilisées pour étudier les systèmes biologiques depuis les années 1960. 10 Durant cette période, une abondance d&#39;expériences de reticulation récepteur-ligand ont été rapportés pour étudier des complexes de GPCR, dont la plupart impliquaient l&#39;utilisation de ligands de photo-affinité 11, 12 Cependant, ceux-ci. applications sont techniquement limités, car ils Requirla synthèse de l&#39;e de ligands portant un groupe de reticulation. 13-15 En outre, avec le groupement réticulant dans le ligand, il est difficile d&#39;identifier l&#39;emplacement de la réticulation sur le GPCR. L&#39;introduction du site-spécifique groupes photoréticulation que SAU en protéines en utilisant le codon ambre technologie de suppression est un progrès important. 16, 17 Nous avons développé une technique de photoréticulation pour identifier l&#39;interface de fixation sur un récepteur qui est impliqué dans la formation d&#39;un complexe récepteur-ligand dans cellules vivantes en introduisant des groupes photolabiles dans les RCPG. 18, 19 Nous décrivons ici le protocole expérimental et la méthode d&#39;analyse des données pour l&#39;application de cette technologie de photoréticulation ciblée pour identifier le site de liaison d&#39;un ligand à petite molécule, le maraviroc tritiée, sur le CCR5. Ce procédé tire parti de la quantification précise de la poignée sur le ligand radioactif, en plus de conserver la structure chimique du ligand natif. Des techniques basées sur la fluorescence en charge la compréhension précise de la base structurelle de l&#39;activation du récepteur en sondant directement l&#39;état conformationnel du récepteur. 20, 21 Cependant, les techniques qui possèdent la flexibilité d&#39;introduire des marqueurs fluorescents dans les GPCR sont site spécifiquement limité. Nous sommes intéressés à utiliser des stratégies de modification chimique bioorthogonal pour faciliter la détection de molécule unique (SMD) de GPCR complexes de signalisation. 22 Le groupe azido peut participer à des chimies bioorthogonal tels que Staudinger-Bertozzi ligature, 23, 24 sans cuivre souche promu azoture cycloaddition alcyne (SpAAC) 25 et de l&#39;azoture-alcyne cycloaddition catalysée par le cuivre (CuAAC). 26 Nous nous concentrons ici sur la réaction de ligature Staudinger-Bertozzi qui implique la réaction spécifique entre un azoture et une phosphine. Nous démontrons l&#39;utilisation de deux dérivés de phosphine, les différents conjugués à un épitope de peptide (peptide FLAG) ou un marqueur fluorescent(Fluorescéine) afin de réaliser la modification spécifique d&#39;un site de GPCR. Nous avons déjà optimisé les conditions d&#39;étiquetage spécifique du site de la rhodopsine variantes AZF en utilisant la structure cristalline aux rayons X et des simulations dynamiques de choisir des sites cibles qui sont exposés au solvant. 27, 28 Nous avons également illustré la faisabilité d&#39;atteindre étiquetage sans fond par Staudinger- ligature Bertozzi. Nous démontrons ici 29 le mode opératoire général utilisé pour réaliser le marquage fluorescent d&#39;un récepteur de détergent solubilisé qui est immobilisé sur une matrice d&#39;immuno-affinité et ensuite visualisés par fluorescence dans le gel. En outre, nous démontrons une extension utile à cette stratégie d&#39;étiquetage pour identifier les positions se prêtant à l&#39;étiquetage sur un récepteur de structure inconnue, CCR5. Ceci est réalisé en utilisant une stratégie de marquage peptide-épitope cible qui repose sur une modification de bioorthogonal AZF-GPCR variants dans un format semi-haut débit à base de cellules. Cette 30méthode exploite les propriétés de détection multi-étapes d&#39;un test ELISA de surface cellulaire pour surveiller les événements en matière d&#39;étiquetage. Les méthodes que nous discutons ici sont générales et peuvent en principe être appliquées à tout GPCR incorporé avec AZF utilisant le codon ambre technologie de suppression. Dans les protocoles présentés ici nous détaillons les étapes impliquées dans l&#39;expression de cellules de mammifères avec des récepteurs intégrés SAU tels que AZF en utilisant le procédé de mutagenèse de l&#39;acide aminé non naturel et leurs applications ultérieures pour faciliter les études structurales et dynamiques de GPCR.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pSVB. Yam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Ye et al., 2008)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pcDNA.RS for azF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Ye et al., 2009)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bio-products</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine Plus</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Lipofectamine: 18324-012 
			Plus: 11514-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-azido-L-phenylalanine</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>6162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima ML-3500S UV-A lamp</td>
			<td>Spectronics Corporation</td>
			<td></td>
			<td>azF is activated by 365-nm light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3117405001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritium-labeled ligand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From collaborator (Grunbeck et al., 2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% (w/v) n-dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1D4-sepharose resin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td>SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD apparatus</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td>Apparatus for semi-dry transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat powered milk</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9934262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>274348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecoscint A</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-273</td>
			<td>Scintillation fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>333726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Beta-Scintillation counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rhodopsin 1D4 mAb</td>
			<td>National Cell Culture Center</td>
			<td>custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td>KPL, Inc.</td>
			<td>474-1806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyblot CL AR film</td>
			<td>Denville</td>
			<td>E3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Targeted photocrosslinking materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15050065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG-triarylphosphine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GPHOS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 FLAG mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CCR5 2D7 mAb</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3601</td>
			<td>Clear bottom, high binding EIA/RIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated</td>
			<td>KPL, Inc.</td>
			<td>474-1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG</td>
			<td>KPL, Inc.</td>
			<td>474-1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>DE Healthcare Products</td>
			<td>97-93399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader</td>
			<td>Perseptive Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein-phosphine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Huber et al., submitted 2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonapeptide (C9 peptide)</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>62190</td>
			<td>Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% (w/v) n-dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1D4-sepharose resin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td>SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Scanner with 488-nm wavelength laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Fluorescent labeling materials</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetically-encoded molecular probes to study g protein-coupled receptors

Pour faciliter les études structurales et dynamiques du G récepteur couplé à la protéine (GPCR) des complexes de signalisation, de nouvelles approches sont nécessaires pour introduire des sondes ou des étiquettes informatives en récepteurs exprimés qui ne perturbent pas la fonction du récepteur. Nous avons utilisé la technologie de suppression de codon ambre génétiquement coder l&#39;acide aminé non naturel, p-azido-L-phénylalanine (AZF) à différents postes ciblés dans GPCR hétérologue exprimées dans les cellules de mammifères. La polyvalence du groupe azido est illustré ici dans différentes applications d&#39;étudier RCPG dans leur environnement cellulaire natif ou sous détergents conditions solubilisées. Tout d&#39;abord, nous démontrons une technologie à base de cellules photo-réticulation ciblée pour identifier les résidus dans la poche de liaison au ligand de GPCR où un ligand à petite molécule marquée au tritium est réticulé à un acide azido aminé génétiquement codé. Nous démontrons alors modification spécifique au site des RCPG par le bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligature réactionstion qui vise le groupe azido en utilisant des dérivés de phosphine. Nous discutons d&#39;une stratégie générale pour l&#39;étiquetage ciblé peptide épitope de protéines membranaires exprimées dans la culture et sa détection en utilisant une approche basée sur ELISA cellule entière. Enfin, nous montrons que AZF-GPCR peuvent être étiquetés de manière sélective avec des sondes fluorescentes. Les méthodes sont discutés général, en ce qu &#39;ils peuvent en principe être appliquée à n&#39;importe quelle position d&#39;acide aminé dans toute GPCR exprimé pour interroger les complexes de signalisation actives.

Nous avons employé la méthode de mutagenèse d&#39;acide aminé non naturel spécifique de site pour introduire des sondes moléculaires dans un GPCR en utilisant le codon ambre technologie de suppression. Le schéma de la figure 1 présente les étapes marquantes de la méthodologie et les différentes applications de l&#39;intégration de la SAU polyvalent, p-azido-L-phénylalanine (AZF), dans les RCPG. Expression de AZF-GPCR dans des cellules de mammifères permet photoréticulation ciblé...

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Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Nous génétiquement coder l&#39;acide aminé non naturel, p-azido-L-phénylalanine à divers postes ciblés dans les RCPG et de montrer la polyvalence du groupe azido dans différentes applications. Ceux-ci comprennent une technologie de photoréticulation ciblée pour identifier des résidus dans la poche de liaison au ligand d&#39;un GPCR, et spécifique à un site de modification bioorthogonal GPCR avec un peptide marqueur d&#39;épitope ou une sonde fluorescente.

Molecular Probes génétiquement codés pour étude g récepteurs couplés à la protéine

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

genetically-encoded-molecular-probes-to-study-g-protein-coupled

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K vues.  The Rockefeller University.  Nous génétiquement coder l'acide aminé non naturel, p-azido-L-phénylalanine à divers postes ciblés dans les RCPG et de montrer la polyvalence du groupe azido dans différentes applications. Ceux-ci comprennent une technologie de photoréticulation ciblée pour identifier des résidus dans la poche de liaison au ligand d'un GPCR, et spécifique à un site de modification bioorthogonal GPCR avec un peptide marqueur d'épitope ou une sonde fluorescente. 

Vidéo: Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Test sensibilité visuelle à la vitesse et la direction du mouvement chez les lézards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Recherche

Biologie

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolement et purification de Drosophile Neurones périphériques en triant bille magnétique

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

Dans la quantification in vivo des interactions des protéines G récepteurs couplés utilisant résolution spectrale microscopie à deux photons

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

Surveillance des changements dynamiques dans les niveaux de calcium mitochondrial cours de l&#39;apoptose en utilisant un capteur de calcium codées génétiquement

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Récepteur d&#39;imagerie couplés aux protéines G (RCPG) à médiation événements de signalisation qui contrôle chimiotactisme des Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell or tissue. This process can be analyzed at the level of a single receptor, a population of receptors, or a downstream response. Here we describe how to analyze the downstream response to obtain an estimate of the agonist affinity constant for the active state of single receptors.
Receptors behave as quantal switches that alternate between active and inactive states (Figure 1). The active state interacts with specific G proteins or other signaling partners. In the absence of ligands, the inactive state predominates. The binding of agonist increases the probability that the receptor will switch into the active state because its affinity constant for the active state (Kb) is much greater than that for the inactive state (Ka). The summation of the random outputs of all of the receptors in the population yields a constant level of receptor activation in time. The reciprocal of the concentration of agonist eliciting half-maximal receptor activation is equivalent to the observed affinity constant (Kobs), and the fraction of agonist-receptor complexes in the active state is defined as efficacy (&#949;) (Figure 2).
Methods for analyzing the downstream responses of GPCRs have been developed that enable the estimation of the Kobs and relative efficacy of an agonist 1,2. In this report, we show how to modify this analysis to estimate the agonist Kb value relative to that of another agonist. For assays that exhibit constitutive activity, we show how to estimate Kb in absolute units of M-1.
Our method of analyzing agonist concentration-response curves 3,4 consists of global nonlinear regression using the operational model 5. We describe a procedure using the software application, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). The analysis yields an estimate of the product of Kobs and a parameter proportional to efficacy (&tau;). The estimate of &tau;Kobs of one agonist, divided by that of another, is a relative measure of Kb (RAi) 6. For any receptor exhibiting constitutive activity, it is possible to estimate a parameter proportional to the efficacy of the free receptor complex (&tau;sys). In this case, the Kb value of an agonist is equivalent to &tau;Kobs/&tau;sys 3.
Our method is useful for determining the selectivity of an agonist for receptor subtypes and for quantifying agonist-receptor signaling through different G proteins.

A method for estimating the affinity constant of an agonist for the active state (Kb) of a G protein-coupled receptor is described. The analysis provides absolute or relative measures of Kb depending on whether constitutive receptor activation is measurable. Our method applies to various responses downstream from receptor activation.

Quantifier l&#39;activité agoniste à G récepteurs couplés aux protéines

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs). The onset of a reverse pharmacology assay is the cloning and subsequent transfection of a GPCR of interest in a cellular expression system. The heterologous expressed receptor is then challenged with a compound library of candidate ligands to identify the receptor-activating ligand(s). Receptor activation can be assessed by measuring changes in concentration of second messenger reporter molecules, like calcium or cAMP. The fluorescence-based calcium mobilization assay described here is a frequently used medium-throughput reverse pharmacology assay. The orphan GPCR is transiently expressed in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells and a promiscuous G&#945;16 construct is co-transfected. Following ligand binding, activation of the G&#945;16 subunit induces the release of calcium from the endoplasmic reticulum. Prior to ligand screening, the receptor-expressing cells are loaded with a fluorescent calcium indicator, Fluo-4 acetoxymethyl. The fluorescent signal of Fluo-4 is negligible in cells under resting conditions, but can be amplified more than a 100-fold upon the interaction with calcium ions that are released after receptor activation. The described technique does not require the time-consuming establishment of stably transfected cell lines in which the transfected genetic material is integrated into the host cell genome. Instead, a transient transfection, generating temporary expression of the target gene, is sufficient to perform the screening assay. The setup allows medium-throughput screening of hundreds of compounds. Co-transfection of the promiscuous G&#945;16, which couples to most GPCRs, allows the intracellular signaling pathway to be redirected towards the release of calcium, regardless of the native signaling pathway in endogenous settings. The HEK293T cells are easy to handle and have proven their efficacy throughout the years in receptor deorphanization assays. However, optimization of the assay for specific receptors may remain necessary.

The here described fluorescence-based calcium mobilization assay is a medium-throughput reverse pharmacology screening system for the identification of functionally activating ligand(s) of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs).

Caractérisation des récepteurs de protéines G couplées par une mobilisation de calcium dosage à base de fluorescence

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

Visualisation endocytose clathrine de G récepteurs couplés aux protéines à un seul événement résolution par microscopie TIRF

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements

Hydroponic systems have been utilized as one of the standard methods for plant biology research and are also used in commercial production for several crops, including lettuce and tomato. Within the plant research community, numerous hydroponic systems have been designed to study plant responses to biotic and abiotic stresses. Here we present a hydroponic protocol that can be easily implemented in laboratories interested in pursuing studies on plant mineral nutrition.
This protocol describes the hydroponic system set up in detail and the preparation of plant material for successful experiments. Most of the materials described in this protocol can be found outside scientific supply companies, making the set up for hydroponic experiments less expensive and convenient.
The use of a hydroponic growth system is most advantageous in situations where the nutrient media need to be well controlled and when intact roots need to be harvested for downstream applications. We also demonstrate how nutrient concentrations can be modified to induce plant responses to both essential nutrients and toxic non-essential elements.

Here, we present an easy-to-follow protocol to establish a successful hydroponic system for plant nutrition studies. This protocol has been extensively tested in Arabidopsis and can easily be adapted to other plant species to study specific nutritional requirements or the effect of non-essential elements on plant growth and development.

Hydroponique: un système polyvalent pour étudier et répartition des plantes Réponses des éléments nutritifs à la disponibilité des éléments nutritifs et l&#39;exposition aux éléments toxiques

Hydroponic systems have been utilized as one of the standard methods for plant biology research and are also used in commercial production for several ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Imaging G Protein-Coupled Receptor-médiée chimiotactisme et ses événements de signalisation dans les cellules HL60 neutrophiles comme

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...