Ces questions peuvent aider à répondre aux questions clés de la recherche sur le VIH/sida, telles que le mécanisme moléculaire et le pronostic de l’infection par le VIH, et comment et où le réservoir de latence est établi. L’avantage de cette technique est qu’elle n’est pas invasive et qu’elle a établi une souris hu-NSG qui doit traiter un développement multi-lignée sur les cellules souches humaines transplantées qui sont sensibles à l’infection par le VIH et qui sont réceptives à la multithérapie. Commencez par filtrer un échantillon digéré, humain, fœtal, hépatique, slurry à travers un stérile, 70 micromètres, nylon, passoire à mailles pour obtenir une suspension à cellule unique, et enrichir pour CD34 + HSCs par tri cellulaire magnétique activé selon les instructions du fabricant.
Après dépouillement, suspendre à nouveau le HSC à une concentration de deux fois dix à sept cellules viables par millilitre de concentration en DPBS frais sur la glace. Placez ensuite un NOD humain néonatal entier/SCID/gamma ou une litière de souris NSG dans une cage stérile, en forme de tarte, irradiation, et traitez les animaux avec 200 à 250 centigrades de rayons gamma provenant d’une source de rayonnement césium-137. Chargez ensuite les cellules dans une seringue Hamilton 80508 de 50 microlitres sur mesure, munie d’une aiguille de calibre 30, et injectez chaque animal néonatal directement dans le foie avec cinq fois dix à cinq CD34+HSC humains viables et 25 microlitres de DPBS.
Dix à douze semaines après l’infection, faites tourner des échantillons de sang rétroorbitaux, périphériques et sanguins de chaque souris par centrifugation, et transférez les supernés plasmatiques dans des tubes de microcentrifugeuse pour un stockage négatif de 80 degrés Celsius, le cas à titre expérimental. Pour la validation de l’engraftment HSC, suspendez les granulés avec 200 microlitres de tampon de lyse de globule rouge, et tirez les suspensions cellulaires dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millimètre pour une incubation de dix minutes à température ambiante. Puis recueillir les globules blancs restants par centrifugation pour deux lavages dans 0,5 millilitres de frais, 0,01 pour cent albumine de sérum bovin, ou BSA, en DPBS par lavage.
Après le deuxième lavage, bloquer les cellules avec 100 microlitres de cocktail bloquant pendant vingt minutes à 4 degrés Celsius suivie de l’étiquetage avec le cocktail anticorps approprié d’intérêt à un 2 microlitres d’anticorps par concentration de cellules une fois une à la sixième. Après 30 minutes à 4 degrés Celsius, lavez les cellules deux fois dans le DPBS frais plus BSA, et évaluez les échantillons périphériques de sang par cytométrie de flux selon les protocoles standard pour quantifier le pourcentage de CD45+CD3+CD14+ou CD19+cellules humaines par échantillon. Calculez ensuite le rapport entre les cellules CD4+/CD8+T, et évaluez la charge virale avec dans les échantillons de plasma selon les protocoles standard, quantitatif, reverse transcriptase, PCR.
Pour évaluer les effets de l’infection par le VIH, livrer le virus des balles de VIH aux souris anesthésiées, humaines, NSG ayant une population humaine de plus de 20 % de cellules CD45+cell dans leur sang périphérique, à un taux de 200 nanogrammes de P24 par souris par administration intraperitoneal, recueillant des échantillons de sang par saignement rétroorbital toutes les deux semaines, et analysant à la fois le rapport CD4-CD8 et la charge virale plasmatique , comme démontré. Pour la validation de suppression virale fournir aux animaux infectés, humains NSG avec frais, combinatoire, thérapie antirétrovirale, ou cART, dans l’eau sucrée chaque semaine pendant 4 semaines, la collecte d’échantillons de sang via des saignements rétro-orbitaux toutes les deux semaines et d’analyser à la fois le rapport CD4-/CD8 et la charge virale plasmatique comme démontré. Pour évaluer le rebond viral lorsque les charges virales plasmatiques sont inférieures à la limite de détection et le rapport CD4-CD8 est restauré entre 1,5 et 2,5 recueillir des échantillons de sang périphériques par le biais de saignements rétro-orbitaux toutes les 2 semaines après le retrait cART et d’évaluer les échantillons tels qu’ils ont été démontrés.
Au cours de la validation initiale de l’engraftment, le nombre humain de cellules CD45+devrait varier de 20 à 80 pour cent, et les sous-ensembles de leucocytes humains devraient apparaître comme des populations discrètes par analyse cytométrique de flux. Le rapport entre cd4+/CD8+cells reste entre 1,5 et 2,5 chez les personnes en bonne santé tandis que l’épuisement significatif des cellules CD4+T est généralement observé lors de l’infection virale. Notamment, le rapport sain est rétabli en réponse au traitement cART.
La détection des charges virales plasmatiques par RT PCR quantitatif tout au long de l’infection et du régime cART peut être tracée et utilisée pour évaluer l’efficacité de la livraison virale et le traitement antiviral, respectivement. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des études de virologie du VIH/sida et du développement thérapeutique, elle peut également être appliquée à d’autres études liées aux maladies humaines, telles que le cancer, le diabète et les maladies auto-immunes. Le développement du modèle de souris hu-NSG a ouvert la voie à des chercheurs en immunologie et en oncologie pour explorer un nouveau dysfonctionnement et pathologie chez l’homme, en particulier des études mécanistes et thérapeutiques ciblant l’infection chronique par le VIH et le réservoir de latence.
