Эти вопросы могут помочь ответить на ключевые вопросы исследований в области ВИЧ/СПИДа, такие как молекулярный механизм и прогноз ВИЧ-инфекции, а также то, как и где устанавливается резервуар задержки. Преимущество этого метода заключается в том, что он неинвазивный, и создана ху-NSG мышей, которые должны лечить развитие нескольких линий над пересаженных стволовых клеток человека, которые восприимчивы к ВИЧ-инфекции и восприимчивы к cART. Начните с фильтрации переваренного, человека, плода, ткани печени, образца суспензии через стерильный, 70-микрометровый, нейлон, сетчатый ситечко, чтобы получить одноклеточную подвеску, и обогатить для CD34'HSCs магнитной активированной сортировки клеток в соответствии с инструкциями производителя.
После подсчета, повторно приостановить HSC в два раза десять-седьмой жизнеспособных клеток на миллилитр концентрации в свежем DPBS на льду. Далее поместите весь неонатальный человеческий NOD/SCID/gamma или NSG мышиный помет в стерильную, в форме пирога, клетку облучения, и лечить животных с 200 до 250 центриградов гамма-лучей из источника излучения цезия-137. Затем загрузите клетки в изготовленный на заказ, Гамильтон 80508 50-микролитровый шприц оснащен 30-го калибра иглы, и вводить каждое неонатального животного непосредственно в печень с пяти раз десять-пятый жизнеспособный человек CD34-HSCs и 25 микролитров DPBS.
Десять-двенадцать недель после инфекции, спина вниз ретро-орбитальных, периферических, образцов крови от каждой мыши центрифугации, и передачи плазменных супернатов в микроцентрифуг трубки для отрицательного 80 градусов по Цельсию хранения в экспериментальном порядке. Для проверки HSC engraftment повторно приостанавливайте гранулы с 200 микролитров буфера лиза красных кровяных телец, и потяните клеточные суспензии в 1,5-миллиметровой микроцентрифугной трубке для десятиминутной инкубации при комнатной температуре. Затем соберите оставшиеся белые кровяные тельца путем центрифугации для двух моет в 0,5 миллилитров свежих, 0,01 процента бычьего альбумин сыворотки, или BSA, в DPBS за стирку.
После второй стирки, блокировать клетки с 100 микролитров блокирующего коктейля в течение двадцати минут при 4 градусах по Цельсию, а затем маркировки с соответствующим анти-тела коктейль интерес на 2 микролитера анти-тела на один раз один-к-шестой концентрации клеток. После 30 минут при 4 градусах по Цельсию, мыть клетки два раза в свежем DPBS плюс BSA, и оценить периферические образцы крови по цитометрии потока в соответствии со стандартными протоколами для количественной оценки процент человека CD45 -CD3-CD14 "или CD19" клеток на образец. Затем вычислите соотношение клеток CD4 и CD8-T и оцените вирусную нагрузку в образцах плазмы в соответствии со стандартными, количественными, обратными транскриптазами, протоколами ПЦР.
Чтобы оценить последствия ВИЧ-инфекции, доставить вирус Тюка ВИЧ для анестезированные, человеческие, NSG мышей с более чем 20 процентов человека CD45-клеток населения в периферической крови, на 200 нанограммов P24 на мышь концентрации через внутриперитонеальной администрации, сбор образцов крови через ретро-орбитальных кровотечений каждые две недели, и анализировать как CD4-к-CD8 соотношение и вирусная нагрузка плазмы , как попродемонстрировано. Для проверки вирусного подавления питания инфицированных, человека NSG животных со свежими, комбинаторные, антиретровирусной терапии, или cART, в подслащенной воде каждую неделю в течение 4 недель, сбор образцов крови через ретро-орбитальных кровотечений каждые две недели и анализировать как CD4-к-CD8 соотношение и плазменной вирусной нагрузки, как попродемонстрировано. Чтобы ослов вирусный отскок, когда плазменные вирусные нагрузки ниже предела обнаружения и CD4-к-CD8 соотношение восстанавливается между 1,5 и 2,5 собирать образцы периферической крови через ретро-орбитальных кровотечений каждые 2 недели после вывода АРТ и оценить образцы, как попродемонстрировано.
Во время первоначальной проверки на цинплантацию количество клеток CD45-клеток человека должно варьироваться от 20 до 80 процентов, а подмножества человеческих лейкоцитов должны отображаться в качестве дискретных популяций путем цитометрического анализа потока. Соотношение клеток CD4 и CD8 остается между 1,5 и 2,5 у здоровых людей, в то время как значительное истощение клеток CD4-T обычно наблюдается при вирусной инфекции. Примечательно, что здоровое соотношение восстанавливается в ответ на лечение АРТ.
Обнаружение плазменных вирусных нагрузок с помощью количественных РТР на протяжении всей инфекции и режима АРТ может быть построено и использовано для оценки эффективности вирусной доставки и антивирусного лечения, соответственно. Хотя этот метод может дать представление об исследованиях в области вирусологии ВИЧ/СПИДа и терапевтическом развитии, он также может быть применен к другим исследованиям, связанным с болезнями человека, таким как рак, диабет и аутоиммунные заболевания. Разработка модели мыши hu-NSG проложила путь для исследователей в области иммунологии и онкологии для изучения новой дисфункции и патологии у людей, особенно механистических и терапевтических исследований, направленных на хроническую инфекцию ВИЧ и резервуар задержки.
