Le nœud et la plaque notochordale sont des organisateurs essentiels lors du développement embryonnaire de la souris. Aujourd’hui, nous allons décrire deux techniques utilisées par les biologistes du développement pour visualiser et étudier ces structures. Dans le premier protocole, nous démontrerons comment effectuer la microscopie électro scannante, sem et dans le second, immunofluorescence entière de montage.
Le nœud et la plaque notochordale sont transitoirement présents à la surface de l’embryon au jour embryonnaire E7.75, accent cilia minuscules projettent à l’extérieur, qui permettent leur identification et visualisation par SEM. Dans les deux protocoles, nous démontrerons des étapes critiques dans la manipulation des embryons de souris relativement petits et nous nous concentrerons sur la façon de les transférer et de les acheminer. Pour commencer, ouvrez l’abdomen d’une souris enceinte euthanasié à travers la peau et les mesenteries.
À l’aide de ciseaux et de forceps fins, retirer l’utérus. Rincez brièvement l’utérus dans de l’eau distillée et placez-le dans une petite boîte de Pétri contenant du PBS. Ensuite, utilisez un microscope disséquant et des forceps fins pour enlever les muscles utérin pour libérer le decidui individuel.
Sous le microscope disséquant, maintenez chaque decidua avec une paire de forceps et utilisez une autre paire pour faire une incision longitudinale et pleine épaisseur entre la partie rouge et la partie blanche. Faire des perforations superficielles verticalement le long de la partie blanche de la decidua, contiguë avec l’incision. Ensuite, tirez le decidua à part horizontalement en deux moitiés et retirez soigneusement l’embryon de la partie blanche de la decidua.
Après cela, transférez les embryons dans une nouvelle boîte de Pétri contenant du PBS filtré stérile. Retirer la membrane de Reichert de chaque embryon, à partir du cône ectoplacental. Pour le génotypage futur, retirer un petit morceau du sac jaune.
Sous une hotte chimique, transférer les embryons dans un tube de microcentrifugeuse contenant un fixitif de qualité EM composé de 2,5 % de glutaraldehyde et de PBS filtré stérile. Après cela, retirer le fixitif du tube sans déranger les embryons. Laver les embryons trois fois dans du PBS stérile et filtré pendant 15 minutes à température ambiante.
Déshydrater les embryons dans une série d’éthanol pendant cinq minutes chacun, en utilisant 50%70%et 85% d’éthanol dilué dans PBS. Laver trois fois à 100 % d’éthanol. Conservez les embryons à 100 % d’éthanol à 20 degrés Celsius ou passez à l’étape suivante.
Après cela, transférez les embroyos sur un récipient approprié et retirez tout liquide restant. Ajouter le SMDS et l’éthanol à un rapport d’un à un pour les embryons pendant 30 minutes. Ensuite, retirez le liquide et ajoutez du HMDS pur pendant 30 minutes.
Retirer le liquide des embryons à l’aide d’une pipette et laisser sécher pendant 30 minutes. Utilisez une petite brosse et du ruban adhésif à double face pour monter les embryons séchés sur les talons SEM, avec les côtés ventraux vers le haut. Insérez les talons dans une machine de revêtement de pulvérisation pour le revêtement de particules d’or.
L’une des étapes les plus délicates de la particule SEM est le montage des embryons dans la bonne orientation sur le talon. Une fois que l’embryon atterrit sur la bande, l’orientation ne peut plus être changée. Après cela, placez les talons enduits dans un microscope SEM, appliquez un vide, et observez les nœuds embryonnaires et les cellules notochordales de plaque avec des cils.
Après avoir enlevé les embryons à E7.75, placez-les dans pbs tween dans une boîte de Pétri sur la glace. Sous une hotte chimique, transférer les embryons dans un tube de microcentrifugeuse contenant une solution fixative. Après cela, retirez le fixatif du tube, en prenant soin de ne pas toucher les embryons.
Ensuite, lavez les embryons trois fois dans le PBS contenant 0,2%Triton X-100 pendant 5 minutes à température ambiante sur un shaker cinglant. Retirer le dernier lavage des embryons et ajouter la solution de blocage contenant du Triton PBS, avec 10% de sérum inactivé par la chaleur. Bloquez les embryons pendant au moins deux heures sur un nutator à quatre degrés Celsius.
Ensuite, retirez le blocage et ajoutez environ un millilitre d’anticorps primaire dilué dans la solution de blocage. Incuber les embryons pendant la nuit sur un nutator à quatre degrés Celsius. Retirez l’anticorps primaire et enregistrez-le pour une utilisation ultérieure.
Ensuite, rincez les embryons avec PBS Triton deux fois. Et lavez-les trois fois pendant 30 minutes sur un nutator. Remplacez le lavage par l’anticorps secondaire conjugué à la florescence diluée contre l’espèce hôte primaire d’anticorps.
Et incuber toute la nuit sur un nutator à quatre degrés Celsius. Ensuite, retirez l’anticorps secondaire et rincez les embryons avec du triton PBS deux fois. Avant de laver trois fois pendant 30 minutes avec PBS Triton.
Remplacer le dernier lavage par du triton PBS contenant de la phalloidine conjuguée à la florescence diluée et du DAPI dilué et de la tache pendant une heure à température ambiante. Ensuite, rincez les embryons deux fois dans PBS Triton. Et lavez-les avec PBS Triton pendant 30 minutes à température ambiante.
Après cela, remplacer le Triton PBS par PBS et laisser les embryons sur la glace. Préparez ensuite des glissières propres et chargées positivement, des feuillets de couverture et des supports de montage à base de glycérol. Placez deux morceaux de ruban adhésif clair à 15 millimètres l’un de l’autre sur la lame.
Ensuite, sous le microscope disséquant, utilisez une pipette P200 modifiée pour déplacer un embryon vers la lame. À l’aide de forceps fins, faire deux coupes complètes sur les côtés latéraux du sac jaune pour déplier l’embryon. Ensuite, placez l’embryon avec le côté ventral vers le haut.
Ajouter 50 microlitres de supports de montage à l’embryon. Ensuite, ajoutez une touche de support de montage à la feuille de couverture. Placez-le à cheval sur les deux morceaux de ruban adhésif, et abaissez-le lentement sur les embryons à l’aide d’une aiguille pliée.
Utilisez un lingette absorbante pour éliminer l’excès de support de montage, en prenant soin de ne pas déplacer le bordereau de couverture. Ensuite, utilisez une généreuse quantité de vernis à ongles pour sceller les côtés de la feuille de couverture. Enfin, utilisez un microscope confocal à balayage pour observer les embryons.
Il est essentiel de ne pas déplacer le glissement de couverture après l’avoir monté sur les embryons, car il peut les déformer pour la visualisation 3D. Utilisant la microscopie électronique de balayage, la formation du nœud dans le type sauvage et dépouiller un embryon de souris mutante à E7.75 a été observée. Contrairement au nœud en forme de fosse de type sauvage, les embryons mutants présentaient un nœud aplati et un nœud régulier et une plaque nodalcordale.
Ensemble maintenant à l’immunofluorescence a été utilisé pour étudier le nœud et les défauts de formation de plaque notochordal dans la bande 1 embryons mutants au niveau cellulaire. Les données ont montré qu’ils étaient anormaux et rabougris dans les embryons mutants. Le nœud et la plaque nodalcortale ne sont présents que transitoirement à la surface de l’embryon, c’est pourquoi le moment est essentiel pour le succès de la SEM.
Par exemple, deux à quatre embryons de somite sont bons pour l’analyse SEM d’un nœud mature avec de longs cils. Les reagents de pureté sont également essentiels au succès de ces techniques, en particulier dans l’enquête de l’ultrastructure par SEM. Les impuretés minuscules qui collent à l’embryon entraînent généralement d’énormes artefacts.
Nous croyons que ces deux techniques donnent des informations complémentaires sur la structure du nœud et de la plaque nodalcortale pendant le développement normal et chez les mutants qui montrent des défauts dans la formation de ces structures.
