Ainsi, en utilisant ce protocole, nous pouvons visualiser les cytonèmes dans le tissu fixe de la souris dans tout l’embryon avec la microscopie optique standard. En utilisant cette technique, nous pouvons sonder les protéines de signalisation endogènes qui se déplacent le long des cytonèmes, plutôt que de compter sur des modèles murins génétiquement manipulés qui utilisent des protéines marquées par fluorescence. Tout en essayant ce protocole, il est important de manipuler doucement les coupes de tissus pour la préservation optimale des cytonèmes.
Miriam Dillard, chercheuse principale de mon groupe, et Christina Daly, étudiante diplômée de St.Jude, feront la démonstration de cette procédure. Pour commencer, utilisez des ciseaux et des pinces à disséquer pour faire une incision en Y dans la cavité péritonéale. Exciser l’utérus contenant l’embryon E 9.5.
Disséquez les embryons dans un milieu de croissance DMEM complet. Utilisez des pinces pour enlever le sac vitellin, le placenta et les membranes environnantes. Rincez les embryons isolés dans HBSS pour enlever tout tissu amniotique résiduel et le sang.
Ensuite, préparez le fixateur en ajoutant du paraformaldéhyde à HBSS pour une concentration de travail de 4% de paraformaldéhyde. Ajouter un millilitre de cette solution à chaque puits d’une plaque de 24 puits. Placez les embryons dans des puits individuels.
Incuber les embryons pendant 45 minutes avec une légère agitation sur une bascule. Après l’incubation, retirez le fixateur et lavez les embryons trois fois, pendant 30 minutes dans du PBS avec du calcium, du magnésium et du triton à 0,1%. Ensuite, incubez les embryons dans une solution bloquante avec une agitation douce deux fois, pendant une heure chacun.
Après la deuxième incubation, rincez les embryons à l’aide d’une solution de blocage fraîche. En attendant, préparez la solution d’anticorps primaire en diluant les anticorps dans du PBS supplémenté. Une fois le rinçage terminé, retirez la solution bloquante et ajoutez un millilitre de solution d’anticorps primaires à chaque puits.
Incuber la plaque à quatre degrés Celsius avec une rotation douce pendant trois jours. Après l’incubation d’anticorps primaires, laver les embryons avec du PBS supplémenté cinq fois pendant une heure sur une bascule à 20 tr / min. Ajoutez ensuite un millilitre de solution d’anticorps secondaires à chaque puits.
Incuber la plaque avec un léger balancement à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant trois jours. Retirez la solution d’anticorps secondaire et lavez les embryons trois fois pendant 30 minutes dans du PBS supplémenté. Préparer une solution à 4% en poids d’agarose à faible point de fusion dans le PBS avec du calcium et du magnésium.
Simultanément, placez une plaque de 12 puits dans le bain de perles à 55 degrés Celsius et ajoutez trois millilitres d’agarose à chaque puits. Ensuite, placez la plaque sur une paillasse et transférez les embryons dans des puits individuels à l’aide d’une cuillère perforée. Utilisez des pointes de pipette pour intégrer et orienter doucement l’embryon de manière à ce qu’il soit centré dans la solution.
Une fois les embryons orientés, placez la plaque à moins 20 degrés Celsius pendant 10 minutes pour la solidification. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, retirez tout le bloc d’agarose du puits. Coupez un bloc rectangulaire autour de l’embryon, en laissant environ 0,3 centimètre du bloc de chaque côté.
Laissez une longueur supplémentaire du bloc le long de l’extrémité caudale de l’embryon. Pour monter l’embryon sur le vibratome, appliquez d’abord une bande de ruban adhésif sur le porte-spécimen. Orientez l’embryon en position verticale dans la partie supérieure du bloc et supercollez le bloc d’agarose sur le ruban, de sorte que la lame génère des sections axiales dans une séquence antérieure à postérieure.
Ensuite, remplissez la chambre vibratoire avec du HBSS froid pour immerger complètement l’échantillon, puis entourez la chambre de glace. Définissez les paramètres sur le vibratome et effectuez une coupe axiale en série de l’embryon. Utilisez des pinces pour transférer des sections individuelles dans un plat séparé rempli de HBSS.
N’oubliez pas d’utiliser des forceps pour ne retenir que l’agarose afin d’éviter les dommages tissulaires et la destruction des cytonèmes. Pour effectuer la coloration F-actine, retirez HBSS et incubez les sections pendant 40 minutes avec ActinRed et la solution DAPI dans un PBS supplémenté. Après l’incubation, laver les sections trois fois pendant 20 minutes dans du PBS supplémenté.
À l’aide d’un stylo marqueur hydrophobe, dessinez une barrière autour des bords d’une lame de microscope chargée et ajoutez un petit volume de HBSS à la zone de remplissage. Ensuite, utilisez des pinces pour transférer des sections vers la diapositive. Enlevez l’excès d’agarose à l’aide d’une pince.
Une fois que toutes les sections ont été transférées sur la glissière, enlevez l’excès de liquide en pipetant et en utilisant le coin d’une serviette absorbante. Ajoutez ensuite plusieurs gouttes de support de montage à la diapositive. Montez le couvercle en le plaçant doucement sur la glissière.
Pour l’analyse, effectuer l’imagerie des coupes tissulaires pour un minimum de trois embryons par génotype sur un microscope confocal ou tout microscope à haute résolution. Les sections correctement orientées préparées à l’aide de ce protocole sont présentées ici. Par rapport à la section vibratome, la section cryostat du tissu n’a pas préservé les extensions cellulaires.
Quelques fragments de membrane GFP positifs ont été détectés entre les cellules de la notochorde et du tube neural, et entre les cellules adjacentes du tube neural dans des sections de cryostat. Cependant, la coloration à la F-actine des extensions cellulaires dans les cellules mésenchymateuses entourant le tube neural a été altérée dans les sections de cryostat. La section vibratome a assuré une perturbation minimale de l’embryon entier et des sections de tissus individuels.
Des sections manipulées de manière optimale ont permis la détection de ctyonèmes entre les cellules épithéliales neurales de la plaque de plancher adjacentement localisées et les cellules mésenchymateuses. Les sections pliées ou bouclées étaient évidentes par une grande séparation entre la notochorde et la plaque de plancher ventrale du tube neural. Et une perte d’extensions de membrane cellulaire migrant entre les cellules épithéliales.
Les sections colorées à la F-actine et au DAPI avaient un espacement constant des cellules mésenchymateuses et des ctyonèmes entourant le tube neural et la notochorde. Des distorsions mineures des sections peuvent avoir provoqué une fragmentation des extensions à base d’actine et la formation de grands espaces entre les cellules, ce qui souligne la nécessité d’une manipulation délicate. Après la section de l’embryon, il est impératif de minimiser toute flexion ou pliage des sections de tissus.
pour prévenir la rupture des cytonèmes. En utilisant cette technique, nous pouvons visualiser directement comment les molécules de signalisation, comme les morphogènes, sont réparties dans les tissus. Cela nous donne de nouvelles perspectives sur la façon dont les tissus et les organes sont modelés.
