Croissance des bactéries magnétotactiques du genre Magnetospirillum: souches MSR-1, 1-AMB et MS-1

Cette méthode permet de cultiver trois espèces différentes de bactéries magnétoactiques appelées MSR-1, AMB-1 et MS-1. Toutes les espèces d’eau douce, et toutes du genre magnétospirillum. Il s’agit d’une première étape essentielle pour toute recherche reproductible impliquant ces organismes.

Les bactéries magnétoactiques ont des besoins en oxygène très spécifiques, c’est pourquoi elles ont développé un système de navigation magnétique. Il est donc très important de contrôler la quantité d’oxygène à leur disposition. Tout ce protocole a été optimisé pour quelques souches spécifiques de magnétospirille d’eau douce.

Ses détails peuvent être optimisés afin de répondre aux besoins en oxygène et en nutriments d’autres bactéries magnétoactiques. Installez en toute sécurité un réservoir de gaz azoté près d’un banc sur lequel il y a suffisamment d’espace pour installer la station d’azote. Connectez un morceau de tube au réservoir qui est assez long pour atteindre la zone où la station sera construite.

Si nécessaire, appliquez du ruban téflon à la sortie du réservoir pour éviter toute fuite. Pour construire une station capable de bouillonner cinq bouteilles de milieu en même temps, couper quatre morceaux de tube d’aproximately cinq centimètres de longueur. Assemblez les morceaux de tube en ligne avec trois raccords en plastique en forme de T à trois sens.

Connectez une extrémité de cette ligne au morceau de tube à la sortie du réservoir d’azote grâce à un raccord supplémentaire en forme de T. Ajouter un raccord de coude à 90 degrés à l’autre extrémité. Utilisez du ruban adhésif pour fixer la structure à une tige métallique horizontale placée aproximately 30 centimètres au-dessus du banc.

Connectez cinq morceaux de tubes d’une longueur aproximately de 20 centimètres aux trois sorties des raccords installés. Retirez les pistons de cinq seringues en plastique d’un millilitre et coupez l’extrémité la plus grande de ces seringues, en ne conservant que la partie graduée. Remplissez ces seringues de coton, en prenant soin de ne pas emballer trop étroitement.

Insérez les seringues dans les tubes verticaux de 20 centimètres de long. Allumez le gaz et utilisez de l’eau savonneuse pour vous assurer qu’il n’y a pas de fuite lorsque l’azote coule. Retirez les bouchons de cinq aiguilles de calibre 25 et insérez ces aiguilles dans des morceaux de tubes minces de 10 centimètres.

Fixez les aiguilles préparées aux seringues de la station d’azote. Assurez-vous que l’azote circule dans les cinq lignes et gardez la station en veille. Préparer une solution de citrate ferrique de 10 millimères en ajoutant 0,245 gramme de citrate ferrique à 100 millilitres d’eau déionisée distillée.

Chauffer et remuer pour dissoudre jusqu’à ce qu’une solution claire orange soit obtenue. Autoclavez la solution à l’aide d’un cycle standard d’au moins 15 minutes d’exposition à 121 degrés Celsius avant de stocker la solution de stock stérilisé à température ambiante dans l’obscurité. Pour préparer cinq bouteilles de milieu de croissance liquide pour MSR-1, ajoutez les produits chimiques énumérés dans un protocole texte à un bécher contenant 300 millilitres d’eau déionisée distillée.

L’ajout du citrate ferrique stérile et des solutions minérales doit être effectué sous la flamme d’un brûleur Bunsen à l’aide de techniques de stérilisation. Les conditions stériles sont essentielles pour éviter la contamination de la culture par d’autres espèces bactériennes. Après l’ajout de tous les produits chimiques, réglez le pH à 7,0 avec une solution molaire d’hydroxyde de sodium.

Distribuez le milieu fraîchement préparé dans des bouteilles de sérum de 125 millilitres, versant 60 millilitres de milieu dans chaque bouteille. Bullez l’azote dans le milieu pendant 30 minutes pour enlever l’oxygène dissous à l’aide du petit tube relié à la station d’azote. Placez un bouchon en caoutchouc butyl sur chaque bouteille, en laissant une petite ouverture pour permettre à l’excès de gaz de sortir de la bouteille.

Après 30 minutes, sertir chaque bouteille avec le bouchon préparé et un joint en aluminium. Le joint en aluminium garantit que la bouteille reste scellée pendant le reste du protocole. Déconnecter les aiguilles et les tubes minces de la station d’azote et les remplacer par des aiguilles propres.

Ajustez les vannes du réservoir d’azote de sorte qu’un flux de gaz doux et continu sorte du réservoir. Maintenant, insérez l’une des aiguilles reliées au réservoir d’azote dans une bouteille de milieu à travers le bouchon en caoutchouc. Insérez immédiatement une autre aiguille propre dans la même bouteille.

Répétez cette étape pour les autres bouteilles, et laissez couler l’azote pendant environ 30 minutes pour remplacer l’air dans les bouteilles par de l’azote. Après 30 minutes, déconnecter une bouteille de la station d’azote en enlevant l’aiguille correspondante. Attendez quelques secondes jusqu’à ce que la pression dans la bouteille de milieu diminue à la pression atmosphérique, et retirez la deuxième aiguille.

Répétez cette étape pour toutes les bouteilles restantes. Pour préparer 120 millilitres de milieu de croissance semi-soluble pour MSR-1, recouvrez le bécher de papier d’aluminium et autoclavez la solution préparée comme décrit dans le protocole textuel. Juste avant la fin du cycle de l’autoclave, préparer une solution fraîche de cystéine de 4% et ajuster le pH à 7,0 avec une solution d’hydroxyde de sodium cinq molaire, tel que décrit dans le protocole de texte.

Après l’autoclaving, laisser refroidir le milieu à 50 à 60 degrés Celsius, et amener le bécher sous la flamme d’un brûleur Bunsen. Retirer le papier d’aluminium et ajouter rapidement les produits chimiques énumérés dans le protocole texte à l’aide de techniques stériles tout en remuant doucement. Ajouter 1,2 millilitres de solution de cystéine stérilisée filtre.

Après l’ajout de tous les produits chimiques, transférer le milieu chaud dans 16 millilitres stérile bouchon à vis Hungate tubes. Transférer 12 millilitres du milieu dans chaque tube et sceller les tubes. Pour inoculer les souches MSR-1, AMB-1 et MS-1 dans un milieu liquide, flammez le dessus de l’oxygène et des bouteilles moyennes fraîches en appliquant de l’éthanol sur les bouchons et en les passant à travers la flamme d’un brûleur Bunsen.

À l’aide d’une seringue stérile et d’une aiguille, extraire un millilitre d’oxygène de la bouteille d’oxygène et la transférer dans la bouteille moyenne fraîche. Si vous utilisez l’inoculum d’une autre culture cultivée dans une bouteille en verre, flammez les deux bouteilles. Puis inoculer un millilitre de la culture plus ancienne dans le milieu frais.

Incuber la culture à 32 degrés Celsius, et l’inoculer dans un milieu frais après quatre à sept jours. Pour inoculer MSR-1 en gradient d’oxygène, milieu semi-solide, vérifiez que le tube de milieu frais affiche un OAI bien défini, matérialisé par une interface rose à incolore d’environ un à trois centimètres sous la surface du milieu. Si l’inoculum vient d’une autre culture semisolide de gradient de concentration d’oxygène, récoltez les bactéries en aspirant 50 microlitres de la culture avec une pointe stérile de pipette placée sur la bande formée par les bactéries.

Inoculer lentement ces bactéries à l’OAI dans le milieu frais, en évitant de perturber l’interface. Sceller le tube et laisser les bactéries se développer entre 25 degrés Celsius et 30 degrés Celsius. Pour s’assurer que les bactéries sont à la fois magnétiques et modales, placez une goutte de culture sur le glissement de couverture du microscope.

Retournez le bordereau de couvercle et installez-le sur un anneau O reposant sur une glissière en verre. Assurez-vous que la chute ne touche pas la glissière inférieure. Placez la goutte suspendue sous un microscope et concentrez-vous sur un bord de la gouttelette.

Placez le pôle sud d’un aimant près de ce bord, et regardez les bactéries nager vers le bord. Retournez l’aimant pour les faire nager dans la direction opposée. On y voit les bouteilles de liquide avant l’inoculation et après la croissance bactérienne.

La turbidité dans la deuxième bouteille indique que les bactéries se développent. Ce film deux fois accéléré montre le résultat attendu d’une expérience de chute suspendue pour une culture modale et magnétique des bactéries magnétoactiques. Les bactéries ont d’abord nagé vers le bord de la gouttelette lorsqu’un champ magnétique est appliqué.

Lorsque la direction du champ de l’aimant est inversée, les bactéries ont nagé loin du bord où le champ magnétique est appliqué. On y voit des tubes de milieu semi-soluble avant l’inoculation et après la croissance bactérienne. Comme prévu, une bande de bactéries se forme à l’interface oxique-anoxique et migre au fil du temps à mesure que l’oxygène est consommé et que l’interface monte.

On y voit un micrographe électronique représentatif d’un spirillum magnétique. La flagelle est indiquée par les flèches noires, tandis que les flèches rouges montrent les magnétosomes. Lors de la tentative de cette procédure, il est très important de se rappeler que les bactéries magnétoactiques ont des besoins très spécifiques niveau d’oxygène afin à la fois de croître correctement et de produire du magnétosome.

Ce protocole montre comment contrôler et surveiller les niveaux d’oxygène dans le média de croissance afin d’atteindre les micro-conditions privilégiées par ces organismes. Suivant cette méthode, des concentrations élevées de cellules saines et hautement magnétiques peuvent être obtenues. De cette façon, des expériences qui nécessitent de grandes quantités de bactéries peuvent être réalisées, telles que l’extraction du magnétosome, des études génomiques et génétiques, ou l’observation du mouvement collectif par microscopie.

La possibilité de cultiver des bactéries magnétoactiques en laboratoire est vraiment ce qui a permis aux scientifiques d’explorer de manière systématique les propriétés biochimiques et physiques fascinantes de ces organismes.