Nous reconnaissons le Dr Amir Aharoni pour son soutien et Geula Davydov, Noam Grimberg et Chen Guttman, pour leurs conseils et commentaires.

1. Clonage et expression des gènes dans les mama E. coli Le gène mutant mamAΔ41 été amplifié en utilisant la réaction en chaîne polymérase (PCR) à partir d&#39;ADN génomique de Magnetospirillum magneticum AMB-1, avec des amorces: 5&#39;-GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG-3 &#39;et 5&#39;-GCGCGGCAGCCATA-TGGCATACG-3&#39;. Dans les fragments d&#39;ADN amplifié, un site Ncol a été introduit au codon d&#39;initiation ATG et le codon de terminaison a été remplacé par un site SCOI. Les fragments ont été digérés avec Ncol et Sacl et clone dans les sites respectifs de pET52b (+), donnant lieu à pET52bMamAΔ41-amb1. Dans cette construction, le gène a été mamAΔ41 fusionnés dans le cadre avec le 10-His à la partie C-terminale. Le plasmide a été électroporés dans la souche E. coli BL21. E. coli souche BL21 hébergeant pET52bMamAΔ41 a été cultivé dans une auto-induction (15) support contenant de l&#39;ampicilline (50 mg / ml) 310 ° K pendant 3 heures. La température de culture a ensuite été déplacé de 310 ° à 300 ° K et maintenu pour une période supplémentaire de 48 heures à 300 ° K. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 5465g pendant 10 min à 277 ° K. 8 litres de culture produit 60 grammes de granulés cellule humide. 2. Les calculs de bioinformatique Calculs de poids moléculaire (MW), selon la séquence des acides aminés et l&#39;absorption prévue de 1mg/1ml de protéines dans 280nm, en utilisant le serveur ProtParam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html). Pour 10His-Tag-MamAΔ41 l&#39;MW 22529 Da (240 acides aminés) et pour MamAΔ41 (avec 9 acides aminés à gauche après son enlèvement par tag-thrombine), le Mw est 20596.5Da (187 acides aminés). L&#39;absorption prévue de 1mg/1ml de protéines dans 280nm pour les 10His-Tag-MamAΔ41 est 0,595 et 0,579 MamAΔ41 est. En outre, la séquence d&#39;acides aminés ne contient pas de résidus cystéine. Par conséquent, les agents réducteurs ne sont pas nécessaires pendant le processus de purification. 3. Purification de MamAΔ41 <ol><li> Pour la préparation de la solution mère, peser et préparer (200 ml chacune) dans les concentrations suivantes: imidazole (228,2 MW g / mol) solution 4M, NaCl (Mw 58,44 g / mol) solution de 5M, Tris-HCl (Mw 121,3 g / mol solution) 1M, ajuster le pH = 8. Ajouter l&#39;eau bidistillée (DDW) et mélanger en utilisant un vortex jusqu&#39;à la solution est claire. Solutions de filtration avec filtre à 0.22μm et garder à température ambiante. </li><li> Préparer et filtre 6 nouveaux tampons à partir des solutions mères (tableau 1). </li><li> Diluer et suspendre les cellules dans le tampon A volume en rapport 1:2, grammes de cellules à mémoire tampon (ml). </li><li> Ajouter 10 ul pour chaque 10gr de bactéries de DNase I (1 mg / ml) afin de briser des fragments d&#39;ADN dans l&#39;échantillon. Ajouter 1ml de chaque 20gr de bactéries sans EDTA cocktail inhibiteur de protéase. Incuber pendant 20 min sur la glace. </li><li> Perturbé les cellules en deux cycles de presse française à 25.000 psi. Contrairement à la sonication, la presse française est destiné à un volume élevé (10ml&gt;) d&#39;extrusion cellulaire en forçant les cellules sous haute pression par un orifice mince. Le piston doit être refroidi sur la glace pendant dix minutes avant son utilisation et de montage en raison de l&#39;accumulation de température. </li><li> Transférer les cellules lysées dans des tubes de 25ml et ultracentrifugeuse les équilibrer avec précision (50mg) avec le tampon A jusqu&#39;à ce que l&#39;échantillon atteint la ligne du cou le tube s. </li><li> Les débris cellulaires par centrifugation séparés Ultra à 270 000 g pendant 1 heure à 277 ° K. </li><li> Préparer une maison gravité Ni NTA colonne (2,5 cm de diamètre) en ajoutant 4 ml de Ni NTA résine, qui sont conserves dans l&#39;éthanol à 20%, sur la colonne. Laissez la chute du liquide complètement, puis laver avec 40 ml de DDW et laisser tomber le liquide complètement. Pré-équilibrée de la résine dans la colonne avec 40 ml de tampon A. </li><li> Appliquer la fraction soluble de l&#39;ultra-centrifugation des tubes sur la gravité Ni NTA colonne. Laissez la chute de fluide, de recueillir à écoulement continu (protéines non) et de préserver au 277K. </li><li> Recueillir un échantillon de granulés à partir des tubes ultra-centrifugation en utilisant un petit pourboire à la ferraille le culot. Mélangez du bout de 50 pl de 5% β-mercaptoéthanol dans le tampon d&#39;échantillon 2X SDS-PAGE. </li><li> Laver la colonne avec 100 ml de tampon B. Laissez la chute de fluide, de recueillir accréditives et de préserver au 277K. </li><li> Préparer 15 tubes Eppendorf marqués (1,5 ml). </li><li> Élution - vanne colonne serrée, puis charger 1ml de tampon C sur la colonne; incuber pendant 3 min, puis en ouvrant la vanne et le débit-à travers la collecte. Répétez cette étape trois fois. </li><li> Eluer reste de la suspension au incrément de 1 ml de tampon C et fermer la vanne. </li><li> Mesurer DO à 280nm des fractions et d&#39;évaluer l&#39;emplacement du pic de protéine, et si la DO est toujours&gt; 0,3, les échantillons supplémentaires sont nécessaires. </li><li> Analyse SDS-PAGE des fractions collectées. Une telle analyse devrait être effectuée aussi avec les échantillons suivants, protéines non accréditives, lavez accréditives et ultra-centrifugation de l&#39;échantillon à granulés. Mélanger 10 ul de chaque échantillon avec 10 ul de 5% β-mercaptoéthanol dans le tampon d&#39;échantillon 2X SDS-PAGE. Charger les échantillons sur 15% SDS-PAGE et courir pendant 45 min à 180 volts. </li><li> Tache le gel dans 15 ml de solution InstantBlue, agiter pendant 1 heure. Assurez-vous que la boîte en plastique est recouvert et protégé de la lumière. </li><li> Évaluer un gel, si l&#39;expression de protéines est élevé et spécifique selon les bandes indicatif, fusion sélectionnées fractions éluées. </li><li> Afin de supprimer les 10-His-tag, ajouter la thrombine bovine (10 unités / ul), 10 ul thrombine par 1 mg de protéine, selon la recommandation du fabricant pour l&#39;échantillon combiné. </li><li> La dialyse est utilisée pour l&#39;enlèvement imidazole excès et à diminuer les concentrations de NaCl pour les niveaux nécessaires pendant l&#39;échange d&#39;ions contraignant. Pour la dialyse, couper la longueur désirée de 7 kDa de poids moléculaire coupé tube à dialyse (MWCO). Laver avec DDW et faire un noeud à une extrémité (ou le sceau avec des clips). Transfert solution de protéines fusionnées sur le sac, tout en laissant peu d&#39;espace en haut et en pince en place. </li><li> Immerger le tube de dialyse en mémoire tampon de 4 litres de dialyse frais (tampon D). Incorporer lentement la solution pendant la nuit à 277 ° K. </li><li> Sortez le tube de dialyse du bécher, faire une petite coupure et le transfert à la protéine de tube 50ml. </li><li> Chromatographie échangeuse d&#39;ions: assembler pré-emballés MonoQ 4.6/100 PE colonne chromatographie liquide rapide (FPLC). Laver la colonne avec 5 volumes de colonne (CV) d&#39;eau filtrée DDW. Équilibrée de la colonne avec 5 CV de tampon D. </li><li> Laver la boucle d&#39;injection avec DDW (deux volumes en boucle) et de répéter avec le tampon D. Charge de la protéine dans la boucle d&#39;injection. </li><li> Injecter l&#39;échantillon de protéine (débit de 1 ml / min) et commencer à recueillir des fractions pour SDS-PAGE de détection des protéines non borné. </li><li> Si le volume protéine initiale (étape 3.23) est plus grande que la boucle d&#39;injection, répétez les étapes 3.25 à 3.26, sans se laver la boucle, jusqu&#39;à ce que tout l&#39;échantillon est chargé sur la colonne. </li><li> Laver la colonne avec 3 CV de tampon C afin d&#39;éliminer les protéines non borné. </li><li> Eluer la protéine avec un gradient linéaire de 60 min 40 2000mm NaCl entre les tampons de D &amp; E (lorsque E tampon de 100% est la fin de la pente), débit 1 ml / min (bien que des débits plus élevés peuvent être utilisés dans le coût de la volumes plus importants, mais moins concentré pics de protéine,). Recueillir des pics de protéines tels qu&#39;ils apparaissent dans le chromatogramme 280nm. </li><li> Nettoyer pré-emballés pour la fabrication de colonnes selon recommandation. </li><li> Analyse SDS-PAGE des fractions collectées. Une telle analyse doit être effectuée avec les échantillons suivants, sans limite d&#39;écoulement des protéines et des protéines grâce à des pics accréditives. Exécutez le SDS-PAGE et coloration que mentionné dans les étapes 3.17 à 3.18. </li><li> Évaluer un gel de protéines des bandes existence à la Mw prédite selon la protéine pré-teint marqueur. Fusionner les fractions d&#39;élution sélectionnées qui contiennent la protéine d&#39;intérêt. </li><li> Dialyser les échantillons fusionnés, afin de réduire les concentrations de NaCl nécessaire pour la chromatographie d&#39;exclusion stérique. Effectuer la dialyse comme mentionné dans les étapes 3.21 à 3.23 contre le tampon F. </li><li> Concentrer l&#39;échantillon de protéines en utilisant un Vivaspin-15 10 000 MWCO à 8 mg / ml dans une centrifugeuse de table, 4000 rpm. Valider la concentration en mesurant le désir de DO à 280nm au Quartz cuvette. Si la protéine est trop concentré, il diluer avec le tampon F et de mesurer à nouveau. </li><li> Assemblez l&#39;exclusion de taille pré-emballés colonne, HiLoad 26/60 Superdex 200, le FPLC; laver la colonne avec 3 CV de l&#39;eau filtrée DDW. Équilibrée de la colonne avec 3 CV de tampon F. </li><li> Laver boucle d&#39;injection avec DDW 5ml (deux volumes en boucle), suivi par le même volume avec le tampon F. Ne chargez pas plus de 4 ml de l&#39;échantillon de protéine dans la boucle d&#39;injection. </li><li> Injecter l&#39;échantillon de protéine (débit de 3,5 ml / min) et commencer à recueillir des fractions de protéines de pointe, tels qu&#39;ils apparaissent sur le chromatogramme on 280nm. Laissez les flux de tampon jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne le volume de la colonne. </li><li> Si le volume protéine initiale (étape 3.23) est plus grande que la boucle d&#39;injection, répétez les étapes 3.25 à 3.26, sans se laver la boucle, jusqu&#39;à ce que tout l&#39;échantillon est chargé sur la colonne. </li><li> Nettoyer pré-emballés colonne selon la recommandation de fabrication. </li><li> Analyse SDS-PAGE des fractions collectées. Une telle analyse devrait être effectuée avec des pics de protéines des échantillons. Exécutez le SDS-PAGE et coloration que mentionné dans les étapes 3.17 à 3.18. </li><li> Évaluer un gel: si les pics de protéines spécifiques, dans le Mw correcte prédite selon la protéine pré-teint marqueur et une seule bande est visible de fusion sélectionnées fractions éluées de la protéine pertinents. </li><li> Concentré de protéines en utilisant un échantillon de Vivaspin-15 10 000 MWCO à&gt; 20 mg / ml dans une centrifugeuse de table, 4000 rpm. Valider la concentration en mesurant le désir de DO à 280nm. Le MamAΔ41 purifiée est ensuite concentré à 26,5 mg / ml pour la cristallisation. </li> &lt;li&gt; Confirmer la pureté de l&#39;échantillon et l&#39;identification de protéines en utilisant Matrix-assisted laser desorption / ionisation (MALDI-TOF). </li><li> Si la protéine est purifiée selon le spectromètre de masse et SDS-PAGE, divisez le MamAΔ41 concentré pour pré-marqués des tubes Eppendorf, 25-50 pl protéine dans chaque. </li><li> Flash congelés dans l&#39;azote liquide et conserver à 193 ° K. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Lorsque ce protocole est fait correctement on devrait obtenir hautement purifiée, des échantillons de taille homogène et concentrée en protéines. Ces échantillons de protéines sont alors prêts pour des essais de cristallisation ainsi que des études biochimiques, tels que la cinétique enzymatique, l&#39;affinité de liaison et plus encore. Décrites ici sont des résultats représentatifs des principales étapes dans le protocole de purification. SDS-PAGE analyse du profil d&#39;élution de Ni-NTA colonne d&#39;affinité devraient révéler hautement plus protéine exprimée dans la fraction soluble à MW appropriée de ~ 22 kDa (figure 1). Cette analyse SDS-PAGE devrait également révéler minimum si aucune protéine dans les protéines non borné accréditives, lavez accréditives et ultra-centrifugation de l&#39;échantillon à granulés. Si de grandes bandes de la protéine appropriée apparaissent dans ces échantillons on devrait envisager la préparation mauvais tampon, les problèmes de rupture des cellules ou des problèmes dans la culture d&#39;auto-induction des conditions et de croissance. Chromatographie échangeuse d&#39;ions est préformé de façon à séparer entre nos protéines souhaitable à d&#39;autres protéines de E. coli qui étaient liés à la résine de nickel (due à des interactions électrostatiques ou histidine / négatif aminés des boucles acides riches en protéines) et non coupés His-tag protéines souhaitable. Cette colonne sépare les protéines en fonction de leur affinité de liaison à la résine chargée positivement dans l&#39;augmentation des concentrations de NaCl. Protéine hautement chargées négativement vont éluer des concentrations plus élevées de NaCl apposer à modérée celles chargées négativement. Les avantages de cette colonne sont haut débit et capacité de liaison. Le chromatogramme d&#39;échange d&#39;ions (Figure 2) révèle une bonne séparation entre les populations des protéines 3 en augmentant la concentration de NaCl. Analyse SDS-PAGE est nécessaire afin de déterminer MW de chaque population, d&#39;isoler le souhaitable et l&#39;évaluation si étapes de purification sont nécessaires. La première population est MamAΔ41 (~ 20 kDa) alors que la deuxième population est MamAΔ41 + Son Tag (~ 22 kDa) qui n&#39;était pas clivé par la thrombine bovine et la troisième population est indétectable dans SDS-PAGE en raison de la faible concentration. Si les pics de protéines ne sont pas clairement séparés on devrait envisager la préparation mauvais tampon ou de changer la pente du gradient de NaCl. Chromatographie d&#39;exclusion stérique est préformé de façon à séparer entre nos protéines souhaitable à d&#39;autres protéines de la cellule de E. coli qui étaient liés à la résine Ni-NTA et n&#39;ont pas été séparés pendant chromatographie échangeuse d&#39;ions. Cette colonne sépare les protéines selon leur taille. Protéines de grande taille seront éluer dans les plus petits volumes d&#39;élution par rapport aux petits qui seront élues dans des volumes plus importants. Le chromatogramme colonne (figure 3) révèle une bonne séparation de la protéine souhaitable car une population principale. La population semble éluer en taille avec un monomère approprié MW de ~ 20 kDa. La présence de la bande ~ 80 kDa (E.coli protéine typique qui lie résine Ni-NTA) est détecté en SDS-PAGE avant le chargement de la colonne et disparaît au cours de cette course. Puisque la concentration de cette protéine ~ 80 kDa est faible au départ, sa population ne figure pas dans le chromatogramme en raison de sa dilution et analyse SDS-PAGE est nécessaire pour déterminer l&#39;efficacité de la purification. Nous recommandons de charger un échantillon dilué et concentré sur le pic principal de la SDS-PAGE ainsi on pourrait sûrement déterminer la présence d&#39;une protéine pure dans la MW appropriée. A ce stade, la protéine est purifiée et son homogénéité doivent être évaluées par MALDI-TOF. Cette analyse a révélé une protéine en MW de 20347 Da et une autre dans Mw de 10 176 Da (Figure 4). La protéine ~ 10 kDa est la protéine ~ 20 kDa doublé facturés. Le MW prévue de MamAΔ41 avec les 9 acides aminés à gauche après son enlèvement a été Tag-20596.5 Da. En la comparant à la MALDI-TOF obtenu MW nous avons constaté qu&#39;ils sont 248 Da à part. Cette dissemblance peut entraîner des erreurs de mesure MALDI-TOF et / ou en raison de la dégradation commune de la première méthionine et la seconde la glycine. Pour conclure, la protéine est hautement purifié et peut être utilisé pour d&#39;autres expériences. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844table.jpg" alt="Tableau 1" /> Tableau 1. Formulations tampon. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Représentant analyse SDS-PAGE de la purification sur colonne Ni-NTA De droite à gauche;. P-ultra-centrifugeuse granulés (3,11 étape du protocole), W-lavage (3,12 étape du protocole), U-sans limite protéines (3,10 étape du protocole), E- cinq voies d&#39;élution SAMPLes (3,14 étape du protocole), M - marqueur protéique (les chiffres indiquent MW). La flèche indique MamAΔ41. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Analyse de la chromatographie échangeuse d&#39;ions étape (a) L&#39;échange d&#39;ions (colonne MonoQ) chromatogramme; Bleu - 280nm absorption, représente la concentration de protéines, vert-de NaCl de concentration, Rouge - indication des fractions collectées. (B) Représentant analyse SDS-PAGE de l&#39;étape de purification par échange d&#39;ions. De gauche à droite, M - marqueur protéique (les chiffres indiquent Mw), A6 - fraction premier pic, fraction du pic A8-seconde. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Analyse par chromatographie d&#39;exclusion de taille (a) l&#39;exclusion Taille (colonne Superdex 200) chromatogramme; Bleu - 280nm absorption, représente la concentration de protéines, l&#39;indication rouge de fractions collectées. (B) Représentant analyse SDS-PAGE d&#39;étape de purification d&#39;exclusion de taille. De gauche à droite; M-protéine marqueur (les chiffres indiquent MW), Prei-pré-injecté l&#39;échantillon, A4-6 fraction combinée recueillies auprès de la première crête, A4-6D-dilué fraction recueillie à partir de la pointe. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Matrix-assisted laser desorption / ionisation (MALDI-TOF) spectre de masse de purifier MamAΔ41. La matrice est acide sinapique (SA). MamAΔ41 montré à 20347 Da, également représentée est l&#39;espèce doublé chargé de MamAΔ41 à 10176 Da.

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Purification des protéines est l&#39;étape principale dans toutes les protéines biochimiques ou des études structurales. Comme chaque protéine est unique avec son propre comportement, on a besoin de définir ses propriétés et de modifier en conséquence sa purification. Protéine cible doit être analysé comme une première étape vers la purification à l&#39;aide d&#39;outils bioinformatiques. Ils sont utilisés pour calculer la cible point isoélectrique, d&#39;évaluer son besoin de réduction / oxydation en...

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<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra-centrifuge</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sorvall</td>
<td>Discovery 90SE</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rottor</td>
<td>Equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>Ti60</td>
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<td>Ultra-centrifuge tubes; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml</td>
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<td>Beckman</td>
<td>BC-355618</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2.5cm diameter, Glass Econo-Column Chromatography Columns</td>
<td>Equipment</td>
<td>BioRad</td>
<td>737-2521</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ni-NTA His Bind resin</td>
<td>Equipment</td>
<td>Novagen</td>
<td>M0063428</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectrophotometer</td>
<td>Equipment</td>
<td>Amersham Biosiences</td>
<td>Ultraspec 2100 pro</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Quartz cuvette</td>
<td>Equipment</td>
<td>Hellma</td>
<td>104-QS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fast Performance Liquid Chromatography- AKTA purifier 10</td>
<td>Equipment</td>
<td>GE Healthcare Biosciences</td>
<td>28-4062-64</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ion exchange column &#x2013; MonoQ 4.6/100 PE</td>
<td>Equipment</td>
<td>GE Healthcare Biosciences</td>
<td>10025543</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Size exclusion pre-packed column-HiLoad 26/60 Superdex 200</td>
<td>Equipment</td>
<td>GE Healthcare Biosciences</td>
<td>17-1071-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centricon - Vivaspin15 &#x2013; 10,000 MWCO</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td>
<td>VS1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Table centrifuge</td>
<td>Equipment</td>
<td>Thermo scientific</td>
<td>IEC CL30R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MALDI-TOF</td>
<td>Equipment</td>
<td>Bruker Daltonics</td>
<td>Reflex IV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris-HCl (hydrotymethyl) aminomethane</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioLab</td>
<td>20092391</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>FRUTROM</td>
<td>235553470</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imidazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>288-32-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA free protease inhibitors cocktail</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-8849</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dnase I (Deoxyribonuclease I)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>DN-25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Thrombin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher BioReagents</td>
<td>BP25432</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioLab</td>
<td>07132391</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Soudim Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioLab</td>
<td>19822391</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Beta-mercaptoethanol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M-3148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>InstantBlue</td>
<td>Reagent</td>
<td>Expedeon</td>
<td>1SB01L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fermentas</td>
<td>SM0671</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

purification of the m. magneticum strain amb-1 magnetosome associated protein mama&delta;41

Bactéries magnétotactique constituent un groupe diversifié de micro-organismes aquatiques qui sont capables de s&#39;orienter le long des champs géomagnétiques. Ce comportement est considéré comme une aide leur recherche d&#39;environnements adaptés<em&gt; (1)</em&gt;. Cette capacité est conférée par l&#39;magnétosome, un organite intracellulaire qui se compose d&#39;un assemblage linéaire de la chaîne des vésicules lipidiques de chaque mesure de biomineralize et joignez un ~ 50-nm cristaux de magnétite ou greigite. Une composante principe de la magnétosome qui a été montré pour être requis pour la formation de vésicules fonctionnelle est maman. Maman est une très abondante magnétosome protéine associée qui est l&#39;un des plus caractérisé magnétosome protéines associées<em&gt; In vivo</em&gt;<em&gt; (2-6)</em&gt;. Cet article se concentre sur la purification de la maman, qui en dépit d&#39;être étudiée<em&gt; In vivo</em&gt;, Aucun des détails clairs fonctionnelles ou structurales ont été identifiées pour elle. L&#39;analyse bioinformatique a suggéré que Mama est une répétition de tétra-tricopeptide (TPR), contenant des protéines. TPR est un motif structural trouve que cette partie ou d&#39;une plus grande formation de pli dans une large gamme de protéines, il sert de modèle pour les interactions protéine-protéine et sert de médiateur complexes multi-protéiques<em&gt; (7)</em&gt;. TPR sont impliqués dans de nombreuses tâches essentielles dans le processus eucaryotes organite cellulaire et de nombreuses voies de bactéries<em&gt; (8-14).</em&gt; Afin de comprendre Mama, un TPR uniques contenant des protéines, la protéine hautement purifiée est nécessaire dans un premier temps. Dans cet article, nous présentons le protocole de purification d&#39;un mutant stable Mama suppression (MamAΔ41) de<em&gt; M. magneticum</em&gt; AMB-1.

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Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

Mama est un unique protéines associées magnétosome qui a été montré pour être impliqués dans l&#39;activation magnétosome. Nous présentons ici le protocole de purification de Mama mutant de délétion (MamAΔ41) de<em&gt; M. magneticum</em&gt; AMB-1.

Purification de la M. magneticum Strain AMB-1 Protein magnétosome Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

purification-m-magneticum-strain-amb-1-magnetosome-associated-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

13.4K vues.  Ben-Gurion University. Mama est un unique protéines associées magnétosome qui a été montré pour être impliqués dans l'activation magnétosome. Nous présentons ici le protocole de purification de Mama mutant de délétion (MamAΔ41) de M. magneticum AMB-1.

Vidéo: Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Recherche

Biologie

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utiliser le système de fractionnement GELFREE 8100 pour les Poids Moléculaire à base de fractionnement avec récupération de la phase liquide

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated anti-cancer drugs or antibiotics, is a current serious problem in public health. This multidrug resistance is largely due to energy-dependent drug efflux pumps. The pumps expel anti-cancer drugs or antibiotics into the external medium, lowering their intracellular concentration below a toxic threshold. We are studying multidrug resistance in Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic bacterial pathogen that causes infections in patients with many types of injuries or illness, for example, burns or cystic fibrosis, and also in immuno-compromised cancer, dialysis, and transplantation patients. The major MDR efflux pumps in P. aeruginosa are tripartite complexes comprised of an inner membrane proton-drug antiporter (RND), an outer membrane channel (OMF), and a periplasmic linker protein (MFP) 1-8. The RND and OMF proteins are transmembrane proteins. Transmembrane proteins make up more than 30% of all proteins and are 65% of current drug targets. The hydrophobic transmembrane domains make the proteins insoluble in aqueous buffer. Before a transmembrane protein can be purified, it is necessary to find buffer conditions containing a mild detergent that enable the protein to be solubilized as a protein detergent complex (PDC) 9-11. In this example, we use an RND protein, the P. aeruginosa MexB transmembrane transporter, to demonstrate how to express a recombinant form of a transmembrane protein, solubilize it using detergents, and then purify the protein detergent complexes. This general method can be applied to the expression, purification, and solubilization of many other recombinantly expressed membrane proteins. The protein detergent complexes can later be used for biochemical or biophysical characterization including X-ray crystal structure determination or crosslinking studies.

In this protocol we demonstrate the expression, solubilization, and purification of a recombinantly expressed membrane protein, MexB, as a soluble protein detergent complex. MexB is a multidrug resistance membrane transporter from the opportunistic bacterial pathogen Pseudomonas aeruginosa.

Expression, Solubilisation détergent, et purification d&#39;un transporteur membranaire, la protéine MexB multirésistance

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction chromatography (HIC) commonly requires experimental determination (referred to as screening or "scouting") in order to select the most suitable chromatographic medium for purifying a given protein 1. The method presented here describes an automated approach to scouting for an optimal HIC media to be used in protein purification.
HIC separates proteins and other biomolecules from a crude lysate based on differences in hydrophobicity. Similar to affinity chromatography (AC) and ion exchange chromatography (IEX), HIC is capable of concentrating the protein of interest as it progresses through the chromatographic process. Proteins best suited for purification by HIC include those with hydrophobic surface regions and able to withstand exposure to salt concentrations in excess of 2 M ammonium sulfate ((NH4)2SO4). HIC is often chosen as a purification method for proteins lacking an affinity tag, and thus unsuitable for AC, and when IEX fails to provide adequate purification. Hydrophobic moieties on the protein surface temporarily bind to a nonpolar ligand coupled to an inert, immobile matrix. The interaction between protein and ligand are highly dependent on the salt concentration of the buffer flowing through the chromatography column, with high ionic concentrations strengthening the protein-ligand interaction and making the protein immobile (i.e. bound inside the column) 2. As salt concentrations decrease, the protein-ligand interaction dissipates, the protein again becomes mobile and elutes from the column. Several HIC media are commercially available in pre-packed columns, each containing one of several hydrophobic ligands (e.g. S-butyl, butyl, octyl, and phenyl) cross-linked at varying densities to agarose beads of a specific diameter 3. Automated column scouting allows for an efficient approach for determining which HIC media should be employed for future, more exhaustive optimization experiments and protein purification runs 4.
The specific protein being purified here is recombinant green fluorescent protein (GFP); however, the approach may be adapted for purifying other proteins with one or more hydrophobic surface regions. GFP serves as a useful model protein, due to its stability, unique light absorbance peak at 397 nm, and fluorescence when exposed to UV light 5. Bacterial lysate containing wild type GFP was prepared in a high-salt buffer, loaded into a Bio-Rad DuoFlow medium pressure liquid chromatography system, and adsorbed to HiTrap HIC columns containing different HIC media. The protein was eluted from the columns and analyzed by in-line and post-run detection methods. Buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection increased the functionality of the system and reproducibility of the experimental approach.

An automated method for identifying suitable hydrophobic interaction chromatography (HIC) media to be used in the process of protein purification is presented. The method utilizes a medium-pressure liquid chromatography system including automated buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection.

Automatisé d&#39;interaction hydrophobe Chromatographie sur colonne de sélection pour l&#39;utilisation dans la purification des protéines

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Purification de Hsp104, une protéine Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identification des partenaires protéine interagissant Utilisation Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression et purification de la protéine transmembranaire de la fibrose kystique conductance Regulator dans Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Bourgeonnement de levure extraction et purification des protéines pour l&#39;étude de la fonction, Interactions, et des modifications post-traductionnelles

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Identification des modifications post-traductionnelles des protéines végétales Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;