Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science Foundation américaine (AER-0920299-0745808 et EAR); US National Science Foundation Asie de l&#39;Est et du Pacifique Instituts d&#39;été; la Geological Society of America Research Grant Programme et les subventions pour la recherche des anciens diplômés et les bourses de l&#39;Ohio State University. Nous tenons à remercier le rédacteur en chef et deux relecteurs anonymes pour leurs commentaires perspicaces.

1. VTT Collection <ol><li> Au moment de décider sur un site d&#39;eau douce pour recueillir des bactéries magnétotactiques (VTT), il est souvent préférable de commencer avec un étang ou à rotation lente cours d&#39;eau qui a une couche de sédiments meubles boueux. Dans cette démonstration, nous avons recueilli un échantillon au bord de la rivière d&#39;Olentangy sur le campus de l&#39;Ohio State University (OSU) à Columbus, dans l&#39;Ohio (États-Unis). Bien que ce fut un emplacement idéal pour notre démonstration, le protocole décrit ici est applicable à n&#39;importe quel endroit aquatique. Les matériaux utilisés dans ce protocole peuvent être trouvés dans le tableau 1. Trouver un endroit où la profondeur de l&#39;eau est comprise entre 10 et 100 cm. À un tel endroit, vous devriez recueillir la couche supérieure de sédiments plus en utilisant un clair vis-top conteneur. Écoper l&#39;eau et des sédiments dans le récipient jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit rempli d&#39;un tiers à la moitié des sédiments et le volume restant d&#39;eau. Conserver le récipient immergé jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit rempli d&#39;eau, puis bien boucher le récipient wvec son vis-top couvercle. Il n&#39;est pas nécessaire de mélanger le sédiment. Essuyez l&#39;extérieur du récipient avec une serviette, puis prendre l&#39;échantillon de votre laboratoire. Il n&#39;est pas nécessaire de se précipiter l&#39;échantillon au laboratoire. Nous avons laissé les échantillons VTT dans des récipients en plastique dans le domaine pendant plusieurs jours avant de les ramener à notre laboratoire. Le VTT doit être viable pendant plusieurs semaines à plusieurs mois, tant que vous stocker les échantillons dans un endroit frais et ombragé dans le domaine. </li><li> Une fois que l&#39;échantillon est dans votre laboratoire, desserrer le bouchon et laisser couvrant le récipient afin de réduire la quantité d&#39;évaporation. Entreposer le contenant à la température ambiante dans une pièce sombre, un tiroir, ou couvrir complètement le récipient avec du papier d&#39;aluminium. Laissez les sédiments et les particules fines de complètement se déposent au fond du récipient en laissant l&#39;échantillon reposer pendant plusieurs heures à plusieurs jours. Il n&#39;est pas nécessaire de mélanger le sédiment, VTT préfèrent un environnement intact. Les parois claires du récipient en matière plastiquevous permettra de confirmer que les particules se sont installés au fond. En fonction de votre échantillon, VTT peuvent rester vivantes dans l&#39;échantillon pendant de nombreux mois. </li></ol> 2. Isolation VTT <ol><li> Lorsque vous êtes prêt à isoler les aimants VTT lieu, sur les côtés du conteneur en plastique d&#39;environ 1 cm au-dessus de l&#39;interface eau-sédiments (figure 1A). Attention à ne pas perturber les sédiments dans le fond du récipient. Placer le pôle sud d&#39;un aimant sur ​​un côté du récipient et du côté nord d&#39;un autre aimant sur ​​le côté opposé (figure 1A). Presque n&#39;importe quel aimant peut être utilisé comme un agitateur magnétique ou aimant de réfrigérateur grande. Tout peut être utilisé pour soutenir les aimants à la bonne hauteur au-dessus de l&#39;interface eau-sédiment. Nous avons constaté que les aimants se reposer sur le dessus d&#39;un carton ou une boîte en plastique est la meilleure, cependant, les aimants peuvent aussi être enregistrées à l&#39;extérieur du récipient en plastique. Attendre 30 minutes à plusieursheures pour les bactéries de se baigner à l&#39;aimant. </li><li> Utiliser une pipette stérile pour recueillir soigneusement l&#39;eau à l&#39;intérieur du conteneur (figure 1A) près de la position de l&#39;aimant sud-pôle (pour les échantillons prélevés dans l&#39;hémisphère Nord). Cette eau doit contenir le MTB qui ont été attirés par l&#39;aimant sud-pôle. Ensuite, une piste de course capillaire doit être utilisé pour enrichir le VTT. </li></ol> 3. VTT Racetrack <ol><li> Afin d&#39;enrichir votre échantillon de bactéries magnétotactiques, une piste de course capillaire est nécessaire (figures 1B et 1C). Celles-ci doivent être faites avant d&#39;isoler les cellules du récipient plastique transparent. </li><li> Utilisez un pouce 5,75 (146 mm) pipette Pasteur en verre pour faire une piste de course. Utilisez un stylo ou un fichier de diamant pour couper le haut de la pipette, la longueur de la pipette n&#39;est pas crucial, mais il devrait être en mesure de contenir environ 1-2 ml d&#39;eau. Ensuite, utilisez un brûleur Bunsen pour faire fondre la pointe de sorte queil devient étanche (Figure 1C). La pipette résultant doit avoir une extrémité ouverte et une extrémité fermée. </li><li> Faites plusieurs de ces hippodromes, puis autoclave. En outre, vous aurez besoin de passer à l&#39;autoclave coton et plusieurs aiguilles métalliques longues. </li><li> Ajouter de l&#39;eau filtrée échantillon, recueilli à partir de l&#39;eau à proximité de l&#39;interface sédiment représenté sur la figure 1A, un circuit à l&#39;aide d&#39;un autoclave métallique de grande longueur d&#39;aiguille montée sur une seringue filtré. La taille des pores du filtre doit être de 0,22 mm pour éliminer les débris et les contaminants de l&#39;eau. Il est important d&#39;être absolument sûr qu&#39;il n&#39;y ait pas de bulles d&#39;air dans le capillaire en verre. </li><li> Branchez le bas de la piste avec du coton stérile (figure 1B). Utiliser l&#39;aiguille métallique pour pousser le coton vers l&#39;extrémité fermée de la piste de sorte qu&#39;il est de 0,5 à 1 cm de distance de l&#39;extrémité fermée (figure 1C). </li><li> En utilisant une pipette stérile, ajouter de l&#39;eau contenant du VTT (section 2.2) à l&#39;échantillon reservoir (extrémité ouverte) d&#39;un circuit VTT préparée (figure 1B). </li></ol> 4. Enrichissement VTT <ol><li> Une fois que le circuit est rempli de liquide échantillon, posez-le sur le côté sur une surface horizontale (par exemple, une table) et placez le pôle sud d&#39;un aimant (dans l&#39;hémisphère Nord) à côté de la pointe scellée du circuit (figures 1B et 1C). </li><li> Attendre 5 à 30 min pour le VTT de migrer à travers le coton. Ensuite, vous devez recueillir le liquide près de l&#39;extrémité de la piste. Attendre trop longtemps peut introduire des contaminants, comme d&#39;autres bactéries mobiles, à la pointe du capillaire. En option, vous pouvez utiliser un microscope optique pour voir le bout de la piste de course et regarder le VTT à frais virés au bout de la piste. Cela vous permettra de déterminer combien de temps il prend le VTT à migrer à travers le bouchon de coton. </li><li> Doucement utiliser le couteau de diamant pour faire une petite égratignure près de bouchon de coton et casser l&#39;extrémité de la piste. </li> &lt;li&gt; Utiliser une seringue de 1 ml avec une aiguille étroite (25 ou 27 gauge) pour retirer le fluide de la pointe de l&#39;hippodrome. Cet échantillon liquide doit maintenant contenir le VTT enrichi. </li></ol> 5. Observation VTT par microscopie optique <ol><li> Déposer une goutte (10-20 pi) de l&#39;échantillon enrichi VTT sur une lamelle. </li><li> Parcourir rapidement la lamelle sur la goutte est donc désormais vers le bas et suspendu à la lamelle. </li><li> Placer la lamelle couvre-objet sur un joint torique qui est en appui sur une lame de verre. Le joint torique doit avoir un diamètre légèrement plus petit que la lamelle (environ 1 cm, figure 2). </li><li> Placez cette goutte suspendue sur une scène microscope optique et de se concentrer sur un bord de la goutte. Un objectif 60X sec fonctionne très bien parce que la plupart ont une grande ouverture numérique (NA, par exemple, 0,93) mais ne nécessitent pas d&#39;huile, ce qui est difficile à utiliser pour la méthode de la goutte suspendue (figure 2). </li><li> Placez l&#39;extrémité sud d&#39;une étroite barre aimantée à la pendaison drop et VTT commence à se déplacer vers le bord de la goutte la plus proche de l&#39;aimant (figure 3). En quelques minutes, VTT nombre devrait être au bord de la goutte (figure 3). Prouvez-vous que les bactéries sont magnétiques en inversant le pôle de l&#39;aimant, puis d&#39;observer les bactéries se baigner dans la direction opposée. </li></ol> 6. Observation VTT par microscopie électronique à transmission (MET) <ol><li> Déposer une goutte (~ 20 pi) du VTT enrichi sur une grille de cuivre et de permettre aux bactéries de s&#39;installer pendant 10 min. </li><li> Évacuent l&#39;excès d&#39;eau avec un morceau de papier filtre propre. </li><li> Éventuellement, la grille peut être négativement colorées avec de l&#39;acétate d&#39;uranyle 2%, 2% pH 7,2 acide phosphotungstique ou de sodium 2,5% de molybdate 7, 8, 9. Ceci est fait en plaçant la grille de cuivre sur une goutte de colorant immédiatement après l&#39;incubation de la grille avec le VTT enrichi. Incuber la grille avec la tache négative, les heures peuvent varier selon le stain utilisé, puis évacuent le liquide avec un morceau de papier filtre propre. </li><li> Observez le VTT par microscopie électronique à transmission (MET, figure 4). Pour les travaux décrits ici ont été adsorbées VTT Formvar stabilisé et revêtues de carbone 200 mailles des grilles de cuivre (Ted Pella # 01800). Les grilles ont été placées avec le côté de carbone sur une goutte de suspension cellulaire pour un maximum de 10 minutes, puis immédiatement lavés une fois en plaçant la grille sur une goutte d&#39;eau pendant 30 secondes. Pour la coloration, les grilles ont été placés sur une baisse de l&#39;acétate d&#39;uranyle 2% (Ted Pella # 19481) pour 30 secondes à 5 minutes, puis séché complètement à l&#39;aide d&#39;un morceau de papier filtre. Les grilles ont été analysés par MET en utilisant soit une FEI 80kV Tecnai Esprit à la FEI ou d&#39;un Tecnai F20 angle à haute tige annulaire champ sombre à 200kV. </li></ol>

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	<li>Blakemore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetotactic+bacteria.">Magnetotactic bacteria.</a> Science. 190, 377-379 (1975).</li><li>Blakemore, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetotactic+bacteria.">Magnetotactic bacteria.</a> Annual Reviews in Microbiology. 36, 217-238 (1982).</li><li>Bazylinski, D. A., Frankel, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Biomineralization+of+Magnetite+(Fe3O4)+and+Greigite+(Fe3S4)+in+a+Magnetotactic+Bacterium.">Controlled Biomineralization of Magnetite (Fe3O4) and Greigite (Fe3S4) in a Magnetotactic Bacterium.</a> Applied and Environmental Microbiology. 61, 3232-3239 (1995).</li><li>Lefevre, C. T., Menguy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cultured+Greigite-Producing+Magnetotactic+Bacterium+in+a+Novel+Group+of+Sulfate-Reducing+Bacteria.">A Cultured Greigite-Producing Magnetotactic Bacterium in a Novel Group of Sulfate-Reducing Bacteria.</a> Science. 334, 1720-1723 (2011).</li><li>Simmons, S. L., Bazylinski, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=South-seeking+magnetotactic+bacteria+in+the+Northern+Hemisphere.">South-seeking magnetotactic bacteria in the Northern Hemisphere.</a> Science. 311, 371-374 (2006).</li><li>Wolfe, R., Thauer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+'capillary+racetrack'+method+for+isolation+of+magnetotactic+bacteria.">A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 45, 31-35 (1987).</li><li>Rodgers, F. G., Blakemore, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+structure+in+a+many-celled+magnetotactic+prokaryote.">Intercellular structure in a many-celled magnetotactic prokaryote.</a> Archives of Microbiology. 154, 18-22 (1990).</li><li>Moench, T. T., Konetzka, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+isolation+and+study+of+a+magnetotactic+bacterium.">A novel method for the isolation and study of a magnetotactic bacterium.</a> Archives of Microbiology. 119, 203-212 (1978).</li><li>Balkwill, D., Maratea, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+a+magnetotactic+spirillum.">Ultrastructure of a magnetotactic spirillum.</a> Journal of Bacteriology. 141, 1399-1408 (1980).</li><li>Lins, U., Freitas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+homemade+apparatus+for+harvesting+uncultured+magnetotactic+microorganisms.">Simple homemade apparatus for harvesting uncultured magnetotactic microorganisms.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 34, 111-116 (2003).</li><li>Jogler, C., Lin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Cloning+of+the+Magnetotactic+Metagenome:+Identification+of+Magnetosome+Island+Gene+Clusters+in+Uncultivated+Magnetotactic+Bacteria+from+Different+Aquatic+Sediments.">Toward Cloning of the Magnetotactic Metagenome: Identification of Magnetosome Island Gene Clusters in Uncultivated Magnetotactic Bacteria from Different Aquatic Sediments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 3972-3979 (2009).</li><li>Lin, W., Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+Isolated+but+Uncultivated+Magnetotactic+Bacterium+of+the+Phylum+Nitrospirae+from+Beijing,+China.">Newly Isolated but Uncultivated Magnetotactic Bacterium of the Phylum Nitrospirae from Beijing, China.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78, 668-675 (2012).</li><li>Li, J., Pan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization,+crystallography+and+magnetic+properties+of+bullet-shaped+magnetite+magnetosomes+in+giant+rod+magnetotactic+bacteria.">Biomineralization, crystallography and magnetic properties of bullet-shaped magnetite magnetosomes in giant rod magnetotactic bacteria.</a> Earth and Planetary Science Letters. 293, 368-376 (2010).</li><li>Oestreicher, Z., Valerde-Tercedor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetosomes+and+magnetite+crystals+produced+by+magnetotactic+bacteria+as+resolved+by+atomic+force+microscopy+and+transmission+electron+microscopy.">Magnetosomes and magnetite crystals produced by magnetotactic bacteria as resolved by atomic force microscopy and transmission electron microscopy.</a> Micron. 43, 1331-1335 (2012).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Magnétotactique bactéries ne sont pas nécessairement dans tous les milieux aquatiques 8, mais quand ils surviennent, ils peuvent être consultés sur l&#39;ordre de 100 - 1.000 cellules par millilitre 2. Afin d&#39;observer le VTT en utilisant la microscopie optique, vous aurez besoin d&#39;environ 50 bactéries / ml dans l&#39;échantillon 8. S&#39;il n&#39;y a pas ou peu de VTT dans votre échantillon, alors vous devrez soit choisir un nouveau site de l&#39;environnement de collecte...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom d&#39;article </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Lames de verre </td><td> Fisher Scientific </td><td> S95933 </td><td></td></tr><tr><td> Verre Pipettes Pasteur </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-6A </td><td></td></tr><tr><td> O-ring </td><td> Droguerie </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lamelles </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542B </td><td></td></tr><tr><td> Barre aimantée </td><td> Fisher Scientific </td><td> S95957 </td><td></td></tr><tr><td> Conteneur </td><td> Tout </td><td></td><td> Toute plastic ou récipient en verre qui peut contenir au moins 0,5 L et peuvent être scellés </td></tr><tr><td> Coton </td><td> Tout </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscope avec objectif à sec 60X </td><td> Zeiss </td><td></td><td> Une lentille 60X sec n&#39;est pas absolument nécessaire, mais cela donne une grande NA sans huile </td></tr><tr><td> Diamant stylo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-675 </td><td></td></tr><tr><td> Filtre de 0,22 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-719C </td><td></td></tr><tr><td> Seringue de 1 ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9788564 </td><td></td></tr><tr><td> Microtubes </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-320 </td><td></td></tr><tr><td> Formvar / Carbone200 mesh, des grilles de cuivre </td><td> Ted Pella Inc </td><td> 01800 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acétate d&#39;uranyle </td><td> Ted Pella Inc </td><td> 19481 </td><td></td></tr><tr><td> Tecnai Esprit TEM </td><td> FEI </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tecnai F20 S / TEM </td><td> FEI </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

collection, isolation and enrichment of naturally occurring magnetotactic bacteria from the environment

Bactéries magnétotactique Tout Terrain (VTT) sont des micro-organismes aquatiques qui ont d&#39;abord été décrits notamment en 1975 1 à partir d&#39;échantillons de sédiments prélevés dans les marais salants de Massachusetts (USA). Depuis VTT ont été découverts dans l&#39;eau et stratifiés sédiments colonnes de partout dans le monde 2. Une caractéristique commune à tous les VTT, c&#39;est qu&#39;ils contiennent magnétosomes, qui sont intracellulaires, nanocristaux liée à la membrane magnétique de la magnétite (Fe 3 O 4) et / ou greigite (Fe 3 S 4) ou les deux 3, 4. Dans l&#39;hémisphère Nord, VTT sont généralement attirés vers l&#39;extrémité sud d&#39;un aimant, tandis que dans l&#39;hémisphère sud, ils sont généralement attirés vers l&#39;extrémité nord d&#39;un aimant 3,5. Cette propriété peut être exploitée lors de la tentative d&#39;isoler VTT à partir d&#39;échantillons environnementaux. Une des façons les plus courantes pour enrichir VTT est d&#39;utiliser un récipient en plastique transparent pour collecter des sédiments et de l&#39;eau d&#39;une source naturelle,comme un bassin d&#39;eau douce. Dans l&#39;hémisphère Nord, l&#39;extrémité sud d&#39;un aimant est placé sur le côté extérieur du récipient juste au-dessus du sédiment à l&#39;interface eau-sédiments. Après un certain temps, la bactérie peut être retiré de l&#39;intérieur du récipient à proximité de l&#39;aimant à la pipette et ensuite enrichie en outre par l&#39;utilisation d&#39;un circuit capillaire 6 et un aimant. Une fois enrichi, les bactéries peuvent être placées sur une lame de microscope en utilisant une méthode de la goutte suspendue et observées dans un microscope optique ou déposée sur une grille de cuivre et observées par microscopie électronique à transmission (MET). En utilisant cette méthode, isolé VTT peuvent être étudiées au microscope pour déterminer des caractéristiques telles que le comportement natatoire, le type et le numéro de la morphologie cellulaire flagelles, des cellules, la forme des cristaux magnétiques, le nombre de magnétosomes, le nombre de chaînes magnétosome dans chaque cellule, la composition de les cristaux nanomineral, et la présence de vacuoles intracellulaires.

Un aimant est un outil efficace qui peut être utilisé pour isoler des bactéries magnétotactiques (MTB) contenues dans des échantillons de l&#39;environnement (Figure 1A). Un circuit capillaire (figure 1B) utilise les propriétés magnétiques des VTT pour les attirer à travers un tampon de coton où ils peuvent être séparés des non-magnétotactiques micro-organismes aussi contenu dans l&#39;échantillon de l&#39;environnement. <p class="jove_content" fo:keep-together.within...

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Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Nous démontrons une méthode pour recueillir les bactéries magnétotactiques Tout Terrain (VTT) qui peuvent être appliquées dans les eaux naturelles. VTT peuvent être isolées et enrichies à partir des échantillons de sédiments à l&#39;aide d&#39;une configuration relativement simple qui tire parti du magnétisme de la bactérie naturelle. VTT isolé peut ensuite être examiné en détail en utilisant à la fois la lumière et la microscopie électronique.

Collecte, l&#39;isolement et l&#39;enrichissement des bactéries présentes naturellement magnétotactique de l&#39;Environnement

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

22.9K vues.  The Ohio State University. Nous démontrons une méthode pour recueillir les bactéries magnétotactiques Tout Terrain (VTT) qui peuvent être appliquées dans les eaux naturelles. VTT peuvent être isolées et enrichies à partir des échantillons de sédiments à l'aide d'une configuration relativement simple qui tire parti du magnétisme de la bactérie naturelle. VTT isolé peut ensuite être examiné en détail en utilisant à la fois la lumière et la microscopie électronique.

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Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

Enrichissement des cellules NK du sang humain avec le Kit de RosetteSep StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Recherche

Biologie

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

Collecte de sang du crabe américaine Horseshoe, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

Isolation des petits ARN non codant de sérum humain

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. Birds are widely used subjects in biological research and are ideal for studies involving repeated sperm samples. However, few resources are currently available for those wishing to learn how to collect and extract DNA from avian sperm. Here we describe cloacal massage, a gentle, non-invasive manual technique for collecting avian sperm. Although this technique is established in the literature, it can be difficult to learn from the available descriptions. We also provide information for extracting DNA from avian semen using a commercial extraction kit with modifications. Cloacal massage can be easily used on any small- to medium-sized male bird in reproductive condition. Following collection, the semen can be used immediately for motility assays, or frozen for DNA extraction following the protocol described herein. This extraction protocol was refined for avian sperm and has been successfully used on samples collected from several passerine species (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanus, and Turdus migratorius) and one columbid (Columba livia).

This protocol describes cloacal massage, a non-invasive manual technique for collecting semen from birds, and DNA extraction from avian sperm using a commercial extraction kit with modifications.

Collecte de sperme aviaire Massage cloacale et l’isolement de l’ADN des spermatozoïdes par

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

Growing Magnetotactic Bacteria of the Genus Magnetospirillum: Strains MSR-1, AMB-1 and MS-1

Magnetotactic bacteria are Gram-negative, motile, mainly aquatic prokaryotes ubiquitous in freshwater and marine habitats. They are characterized by their ability to biomineralize magnetosomes, which are magnetic nanometer-sized crystals of magnetite (Fe3O4) or greigite (Fe3S4) surrounded by a lipid bilayer membrane, within their cytoplasm. For most known magnetotactic bacteria, magnetosomes are assembled in chains inside the cytoplasm, thereby conferring a permanent magnetic dipole moment to the cells and causing them to align passively with external magnetic fields. Because of these specific features, magnetotactic bacteria have a great potential for commercial and medical applications. However, most species are microaerophilic and have specific O2 concentration requirements, making them more difficult to grow routinely than many other bacteria such as Escherichia coli. Here we present detailed protocols for growing three of the most widely studied strains of magnetotactic bacteria, all belonging to the genus Magnetospirillum. These methods allow for precise control of the O2 concentration made available to the bacteria, in order to ensure that they grow normally and synthesize magnetosomes. Growing magnetotactic bacteria for further studies using these procedures does not require the experimentalist to be an expert in microbiology. The general methods presented in this article may also be used to isolate and culture other magnetotactic bacteria, although it is likely that growth media chemical composition will need to be modified.

Growing Magnetotactic Bacteria of the Genus Magnetospirillum: Strains MSR-1, AMB-1 and MS-1

We present a procedure for growing several strains of Magnetospirillum in two different types of growth media. Magnetospirillum gryphiswaldense strain MSR-1 is grown in both liquid and O2 concentration gradient semi-solid media while M. magneticum strain AMB-1 and M. magnetotacticum strain MS-1 are grown in liquid medium.

Croissance des bactéries magnétotactiques du genre Magnetospirillum: souches MSR-1, 1-AMB et MS-1

Magnetotactic bacteria are Gram-negative, motile, mainly aquatic prokaryotes ubiquitous in freshwater and marine habitats. They are characterized by their ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

Isolement des cellules myoépithéliales des glandes murines lacrimal et sous-mandibulaires adultes

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Isolement et enrichissement des cellules progénitrices épithéliales pulmonaires humaines pour la culture organoïde

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate pesticide exposure of bees via pollen. Described herein is an effective pollen-trapping method for collecting corbicular pollen from honey bees returning to their hives. This collection method results in large quantities of corbicular pollen that can be used for research purposes. Honey bees collect pollen from many plant species, but typically visit one species during each collection trip. Therefore, each corbicular pollen pellet predominantly represents one plant species, and each pollen pellet can be described by color. This allows the sorting of samples of corbicular pollen by color to segregate plant sources. Researchers can further classify corbicular pollen by analyzing the morphology of acetolyzed pollen grains for taxonomic identification. These methods are commonly used in studies related to pollinators such as pollination efficiency, pollinator foraging dynamics, diet quality, and diversity. Detailed methodologies are presented for collecting corbicular pollen using pollen traps, sorting pollen by color, and acetolyzing pollen grains. Also presented are results pertaining to the frequency of pellet colors and taxa of corbicular pollen collected from honey bees in five different cropping systems.

We describe methods for collecting corbicular pollen from honey bees as well as protocols for color sorting, acetolysis, and microscope slide preparation of pollen for taxonomic identification. In addition, we present pellet color and taxonomic diversity of corbicular pollen collected from five cropping systems using pollen traps.

Collecte et identification du pollen des colonies d’abeilles mellifères

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries implemented strategies based on direct human testing, face covering, and surface disinfection. Under the assumption that the main route of transmission includes aerosols and respiratory droplets, efforts to detect SARS-CoV-2 in fomites have focused on locations suspected of high prevalence (e.g., hospital wards, cruise ships, and mass transportation systems). To investigate the presence of SARS-CoV-2 on surfaces in the urban environment that are rarely cleaned and&#160;seldomly disinfected, 350 citizens were enlisted from the greater San Diego County. In total, these citizen scientists collected 4,080 samples. An online platform was developed to monitor sampling kit delivery and pickup, as well as to collect sample data. The sampling kits were mostly built from supplies available in pandemic-stressed stores. Samples were processed using reagents that were easy to access despite the recurrent supply shortage. The methods used were highly sensitive and resistant to inhibitors that are commonly present in environmental samples. The proposed experimental design and processing methods were successful at engaging numerous citizen scientists who effectively gathered samples from diverse surface areas. The workflow and methods described here are relevant to survey the urban environment for other viruses, which are of public health concern and pose a threat for&#160;future pandemics.

A citizen science project was designed to recruit San Diego residents to collect environmental samples for SARS-CoV-2. A multilingual web-based platform was created for data submission using a user-friendly mobile device interface. A laboratory information management system facilitated the collection of thousands of geographically diverse samples with real-time outcome tracking.

Écouvillonner l’environnement urbain - Un pipeline pour l’échantillonnage et la détection du SARS-CoV-2 dans les réservoirs environnementaux

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

Fixation et isolement rapides in vivo de complexes translationnels à partir de cellules eucaryotes

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...