À l’aide des analyses présentées ici, la différence de phénotype entre les souches de rotavirus peut être évaluée, lorsque des souches uniques sont isolées. Plus précisément, le changement phénotypique des souches désinfectantes résistantes au rotavirus est étudié. Pour obtenir des extrants quantitatifs clairs à l’aide de l’analyse de la plaque, il est essentiel de choisir une combinaison appropriée de souche rotavirus et de sérum, dans laquelle le rotavirus est bien adapté au sérum.
Syun-suke Kadoya, doctorant de mon laboratoire, démontrera la procédure. Retirez un CryoTube contenant des lignées cellulaires MA104 du contenant d’azote liquide. Placez le CryoTube dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pour décongeler les cellules.
Ajouter un millilitre de la suspension cellulaire à 20 millilitres du milieu contenant du sérum dans un flacon T75. Incuber le flacon dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de CO2 pendant deux à trois jours. Une fois que le monocouche cellulaire atteint 80% de confluence, retirez le supernatant et lavez les cellules deux fois avec cinq millilitres de PBS de 1X Dulbecco.
Ajouter quatre millilitres de 0,05% trypsine-EDTA à la fiole, et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes pour détacher les cellules de la fiole. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et la centrifugeuse à 190 g pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules granulées dans un millilitre de milieu contenant du sérum.
Ensuite, diluer les cellules résuspendées 100 fois avec le milieu. Ajouter trois millilitres de suspension cellulaire diluée à chaque puits d’une plaque de six puits pour l’analyse de la plaque. Ajouter un millilitre de suspension cellulaire diluée à chaque puits d’une plaque de 24 puits pour l’analyse de liaison cellulaire.
Incuber les plaques dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de vapeur sous-saturée de CO2 pendant deux ou trois jours. Transférer un tube contenant un millilitre de la suspension virale dans un milieu sans sérum de stockage à moins 80 degrés Celsius à un bain d’eau de 37 degrés Celsius pour décongeler. Ajouter un microgramme par microlitre de trypsine du pancréas porcin à un millilitre de la suspension du virus, puis vortex.
Incuber la suspension virale à 37 degrés Celsius et 5% de vapeur sous-saturée de CO2 pendant 30 minutes. Diluer la suspension virale activée avec un milieu sans sérum pour ajuster la multiplicité de l’infection, ou MOI, à 0,1 pfu par cellule. Ajouter un millilitre de la suspension du virus dilué aux cellules MA104 dans un flacon T75 trois jours après le placage cellulaire.
Incuber les cellules avec le virus à 37 degrés Celsius pendant une heure, en secouant doucement le flacon toutes les 15 minutes. Ajouter ensuite 30 millilitres d’un milieu sans sérum contenant quatre microgrammes par millilitre de trypsine du pancréas porcin au flacon. Incuber le flacon à 37 degrés Celsius et 5 % de vapeur sous-saturée de CO2.
Recueillir un millilitre du surnatant dans le flacon à zéro, six, 12, 18, 24 et 36 heures après l’infection, et remplacer le supernatant dans les types de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette. Effectuer un cycle gel-dégel dans les 15 minutes à moins 80 degrés Celsius suivi d’une fonte de 15 minutes dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Puis centrifuger les tubes à 12 600 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Recueillir le surnatant. Filtrer le supernatant à l’aide d’un filtre distillé de 0,2 micron pour enlever la fraction cellulaire. Conserver le surnatant à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit appliqué sur l’essai de plaque pour mesurer le titer du virus.
Lorsque vous êtes prêt à effectuer l’analyse de la plaque, placez les tubes contenant le supernatant recueilli dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Ajouter la trypsine à un millilitre d’échantillon dilué 10 fois et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pendant cette incubation de 30 minutes, lavez soigneusement les cellules MA104 dans une plaque de six puits avec deux millilitres de 1X PBS après avoir enlevé le milieu contenant du sérum.
Diluer périodiquement les échantillons incubés avec un milieu sans sérum et inoculer un millilitre de l’échantillon dilué dans chaque puits. Incuber la plaque pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de vapeur sous-saturée de CO2, en secouant doucement la plaque toutes les 15 minutes. Après l’incubation, retirer l’inoculum de la plaque de six puits.
Ajouter quatre microgrammes par millilitre de trypsine au milieu préparé. Ajouter délicatement mais immédiatement trois millilitres du milieu mélangés avec du gel d’agarose à chaque puits. Laisser le gel d’agarose se solidifier à température ambiante pendant plus de 10 minutes.
Puis incuber la plaque pendant deux jours à 37 degrés Celsius et 5% de vapeur sous-saturée de CO2. Ensuite, ajoutez un millilitre de solution rouge neutre de 0,015 % diluée avec 1X PBS à chaque puits, et incubez avec les mêmes conditions. Retirer le colorant au bout de trois heures et continuer à couver pendant une journée.
Le lendemain, comptez le nombre de plaques dans chaque puits et calculez le pfu par millilitre. Vérifiez soigneusement la confluence cellulaire avant l’analyse de la plaque pour assurer les numéros de plaque. Pour l’analyse de liaison cellulaire, ajouter un microgramme par microlitre de trypsine d’un pancréas porcin à un millilitre de la suspension du virus, puis vortex.
Diluer la suspension virale avec un milieu sans sérum pour ajuster le MOI à un pfu par cellule. Lavez les cellules MA104 deux fois dans une plaque de 24 puits avec un millilitre de solution saline tamponnée par tris. Maintenant inoculer les cellules avec 100 microlitres de suspension de virus dilué dans chaque puits de la plaque de 24 puits.
Incuber la plaque à quatre degrés Celsius pendant 90 minutes avec des secousses douces toutes les 15 minutes. Enlevez l’inoculum du virus et lavez les cellules deux fois avec un millilitre de solution saline tamponnée par tris. Pour extraire l’ARN à double brin du rotavirus, ajouter 140 microlitres de 1X PBS et 560 microlitres du tampon d’extraction d’ARN à chaque puits.
Mélanger adéquatement avec une pipette jusqu’à ce que la brume des cellules dans le tampon n’est pas vu. Après avoir récupéré l’ARN à double brin, selon le protocole du fabricant, placez les tubes de 1,5 millilitre, contenant l’extrait d’ARN à double brin, sur un bloc thermique à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour dénoturer l’ARN. Ensuite, placez immédiatement les tubes sur la glace et incubez pendant plus de deux minutes.
Synthétiser l’ADN en utilisant un kit de transcription inversée. Ajoutez quatre microlitres de solution d’ARN viral dénaturé à un tube PCR contenant 16 microlitres de mélange de réaction, et mélangez-le soigneusement avec une pipette afin de ne pas générer de bulles. Après avoir tourné dans les tubes, effectuer la transcription inverse avec un thermocycleur.
Pour le PCR quantitatif, utilisez une sonde d’insertion quencher ciblant la région 963 à 1 049 du segment du génome du NSP3 du rotavirus. Diluer en série le plasmide standard avec de l’eau de qualité PCR, et procéder à faire le mélange principal pour pcr quantitative. Ajouter 20 microlitres du mélange principal aux puits d’une plaque PCR de 96 puits.
Mélangez ensuite cinq microlitres d’échantillons d’ADNC ou cinq microlitres du plasmide standard par pipetting 10 fois. Effectuez un PCR quantitatif selon les conditions du protocole texte. Enfin, calculer le génome du rotavirus lié à la surface de la cellule MA104 tel que décrit dans le protocole texte.
On voit ici une courbe de croissance du rotavirus. En appliquant la méthode la moins carrée à un modèle Gompertz modifié, le taux de croissance spécifique est estimé à 0,197, et la période de décalage est estimée à 6,61 heures. Le titer relatif de virus à la phase stationnaire au titer initial est 3.15.
Sur les six clones testés de rotavirus, les valeurs estimées du taux de croissance spécifique allaient de 0,19 à 0,27. Ces valeurs estimées sont fiables parce que le coefficient de valeurs de détermination dans le raccord du modèle est supérieur à 0,98. Le résultat de l’analyse de liaison cellulaire est affiché comme l’efficacité de liaison, qui est le rapport des particules virales liées à celles présentes dans l’inoculum.
Nos virions rv se liant aux surfaces cellulaires sont d’environ 10 000 exemplaires par millilitre avec une efficacité de liaison d’environ 1% lors de l’utilisation d’une plaque de 24 puits pour l’analyse de liaison cellulaire. Puisque les cellules cultivées sont sensibles aux contraintes physiques, prenez soin de verser le tampon et l’agar doucement mais rapidement. Essentiellement, un nouveau système pour les virus a été introduit.
En utilisant ce système, nous pouvons évaluer la capacité réelle de liaison cellulaire et le taux de croissance spécifique avec des instruments. Notre protocole est avantageux dans la mesure du trait phénotypique. En vérifiant différentes souches nouvellement émergentes, vous pouvez aider à évaluer ses nouveaux vaccins contre les virus.
Les virus sont désignés comme pathogènes BSL-2, de sorte que vous devrez préparer des salles expérimentales BSL-2 pour effectuer cette procédure.
