Ce projet a été financée par la subvention 1R03MH08127-01 et 7R03MH08127-02 du NIH à Q. Li, et par les fonds d&#39;IMPACT du Département de médecine de l&#39;UAB à Q. Li. Le soutien du Fonds Molette et l&#39;Université d&#39;Auburn est appréciée. Nous remercions également les aides techniques de Mme Pulin Che et M. Volodymyr Musiienko au cours des travaux.

Une. Cellules, virus et les composés antiviraux <ol><li> Maintenir les cellules BSR, un dérivé de rein de bébé hamster (BHK), les cellules 10 dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 5% de sérum de veau foetal (FCS), 100U/ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine. </li><li> Pour les trois essais, les cellules de la plaque dans du DMEM avec 1% de FCS, 100U/ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine, comme précédemment optimisés 5. Ce milieu est désigné en tant que milieu de test pour chacun des trois essais. </li><li> Incuber les cellules dans l&#39;incubateur à 37 ° C, avec 5% de CO 2 et de 80 à 95% d&#39;humidité. </li><li> Plaque-purifier et de propager le type 10 BTV (BTV-10) comme décrit précédemment 8. Diluer BTV-10 en milieu de dosage pour chacun des essais désignés. </li><li> Dissoudre tous les composés d&#39;essai dans du DMSO pour former un stock de concentration à 10 mM. Conserver les stocks à -20 ° C. </li><li> Diluer les composés à des concentrations désirées en utilisant un milieu de dosage pour la personne désignéed 2 dosages. </li></ol> 2. Essai sur la base-CPE en utilisant le kit CTG <ol><li> Semences cellules BSR dans une microplaque 384 puits (noir, le format de 16 x 24) par l&#39;intermédiaire MicroFlo sélectionnez distributeur. La densité d&#39;ensemencement est de 5000 cellules / puits et le volume d&#39;ensemencement est de 20 pi pour l&#39;analyse de l&#39;efficacité antivirale. </li><li> Incuber les cellules pendant 2-3 heures jusqu&#39;à obtenir des cellules adhérentes à la plaque à fond. </li><li> Ajouter composé antiviral avec une concentration finale de 10 pM à chaque puits. Mélanger complètement. </li><li> Diluer BTV à titre désiré et ajouter 5 pi BTV avec MOI notée à chaque puits. Pour le contrôle du puits, ajouter 5 ul de milieu de dosage. Incuber les cellules infectées pour 72 heures à 37 ° C, avec 5% de CO 2 et de 80 à 95% d&#39;humidité. </li><li> À 72 hpi, dégel et équilibrer tampon CTG et le substrat CTG lyophilisé à la température ambiante avant de l&#39;utiliser. Reconstituer la solution de réactif CTG homogène en mélangeant l&#39;enzyme / substrat et le réactif lyophilisé tampon selon la thles instructions du fabricant de e. </li><li> Equilibrer les plaques de dosage à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Ajouter un volume égal (25 ul) de réactifs CTG dans chaque puits par un distributeur. Après une incubation de 15 min à température ambiante dans l&#39;obscurité, mesurer des signaux de luminescence en utilisant un lecteur multi-mode avec un temps d&#39;intégration de 0,1 s. </li></ol> 3. Dose-réponse Assay <ol><li> Semence des cellules BSR dans une microplaque à 384 puits (noir; format en 16 x 24) par l&#39;intermédiaire d&#39;un distributeur, avec une densité d&#39;ensemencement de 5000 cellules / puits dans un volume d&#39;ensemencement de 20 ul pour le dosage de l&#39;efficacité antivirale et 25 ul pour le dosage de cytotoxicité, respectivement . </li><li> Incuber les cellules pendant 2-3 heures à 37 ° C, avec 5% de CO 2 et de 80 à 95% d&#39;humidité jusqu&#39;à ce que les cellules sont bien fixés à la plaque. </li><li> Procédé de dosage dans une zone de quart de la plaque de 384 puits pour chaque composé (équivalent à une plaque de 96 puits), comme indiqué dans le tableau 1. Allouer huit répétitions pour chaque concentrationdans un seul dosage. Attribuez la première colonne que le contrôle positif sans ajout de composé et virus, et la dernière colonne (12 e) comme contrôle négatif en ajoutant virus seulement sans composés. </li><li> Diluer les composés à 50 uM dans le milieu d&#39;essai et ajouter à la colonne 2 ème à 20 ul / puits pour le dosage de l&#39;efficacité antivirale. Mélanger le composé à cinq reprises en utilisant une pipette à 8 canaux semi-automatique à une concentration de 25 uM. </li><li> Utilisation de la pipette semi-automatique à 8 canaux, transférer 20 mélange de pi en 2 ème colonne à la colonne suivante (3 e), bien mélanger pour former une concentration de 12,5 uM. Répéter ce processus en transférant 20 ul de mélange de 3 ème colonne de la colonne suivante (4 e) pour former une autre double dilution à une concentration de 6,25 pM. Répétez cette dilution en série deux fois jusqu&#39;à la 11 ème colonne. Aspirer et jeter 20 pi du mélange dans 11 ième colonne après l&#39;ajout et le mélange de l&#39;échantillonplaies. </li><li> Ajouter basé sur MOI de 0,01 BTV-10,, dans chaque puits de la colonne 2 à la colonne 11 avec un volume de 5 ul / puits. Après avoir ajouté le virus, la concentration en composé final dans chaque colonne doit être de: 20 uM dans la colonne 2, 10 uM dans la colonne 3, et continue avec une dilution au double de la colonne 11 vers le bas avec une concentration finale de 0,04 uM. </li><li> Ajouter 5 ul de milieu à la colonne 1 que la cellule ne contrôle (positif) et 5 pl / puits de BTV à la colonne 12 de l&#39;infection virale ne contrôle (négatif). </li><li> Diluer les composés à une concentration initiale de 200 uM pour le dosage de cytotoxicité. De même, ajouter 25 pl / puits de composé à la colonne 2 et 5 fois mélangé avec pipette semi-automatique à 8 canaux à une concentration de 100 uM. Ne pas ajouter de BTV. </li><li> Effectuer la série dilution deux fois par aspiration 25 pi de la colonne 2 de la colonne voisine 3, et a continué jusqu&#39;à la dernière colonne (12 e). A la colonne 12, après mélange, aspirer et rejeter 25 ul de mélange. La concentration finale de la colonne 2 doit être de 100 uM et le 12 e colonne doit être à 0,2 uM. La colonne 1 est le seul contrôle de la cellule. </li><li> Pour les deux dosages de cytotoxicité et de l&#39;efficacité antivirale, incuber les plaques à 37 ° C, avec 5% de CO 2 et de 80 à 95% d&#39;humidité pendant 72 post-traitement d&#39;une heure. Mesurer la viabilité des cellules en utilisant le kit CTG comme décrit ci-dessus (protocole étapes 2.5 à 2.7). </li></ol> 4. Temps de Addition (TOA) Dosage <ol><li> Cellules semences de BSR de la colonne 1-24 dans une microplaque 384 puits (noir, le format de 16 x 24) par l&#39;intermédiaire d&#39;un distributeur à 5.000 cellules / puits et le volume de semis est de 15 pl / puits. </li><li> Pour chaque composé, utiliser toutes les vingt-quatre colonnes avec huit répliques pour chaque point de temps dans une moitié de la plaque de 384 puits (tableau 2). Attribuer la colonne 1 que les cellules ne contrôle en ajoutant 10 pl / puits moyen essai. Mark colonne 24 que l&#39;infection virale que de contrôle (contrôle négatif) en ajoutant 5 ul / puits dosage moyen d&#39;unvirus d 5 ul / puits à une MOI de 0,01 et un volume final de 25 pl / puits. </li><li> Sélectionnez les colonnes impaires de la colonne 2-22 de la colonne d&#39;évaluation de l&#39;efficacité comme antiviral à différents infection heures de poste (HPI). Dans ces colonnes, infecter les cellules avec 5 pl / puits BTV à une MOI de 0,01. Au hpi différent, aussi ajouter 5 ul / puits composé dilué dans chaque puits pour former un volume final de 25 pl / puits. Pour le notées -2 et -1 hpi ajouter composé de cellules BSR avant l&#39;infection virale. Pour 0 hpi, ajouter le composé et BTV à la culture en même temps. </li><li> En parallèle, désigner les colonnes impaires à partir de la colonne 3 à 23 en tant que composé ne contrôle que, de ce composé ont été ajoutés à différents points de temps désigné (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 hpi). Dans ces colonnes, ajouter 5 pl de milieu / puits de dosage et de 5 pl / puits dilué composé pour former un volume final de 25 pl / puits. </li><li> Après le traitement, les cellules incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 avec 80 à 95% d&#39;humidité. </li><li> Déterminer la viabilité des cellules à 72 hpi en utilisant le kit CellTiter-Glo comme décrit précédemment (protocole étapes 2.5 à 2.7). </li></ol> 5. Analyse des données <ol><li> Traiter toutes les données de la première utilisation du logiciel approprié en interne sur la base des signaux luminescents obtenus via le lecteur multi-mode. Déterminer la valeur moyenne (moyenne), l&#39;écart-type (STDEV) pour chaque traitement ainsi que les variations de coefficient (CV), qui nécessite une valeur supérieure à 10%. </li><li> Transférer les données traitées par le logiciel ci-dessus pour un outil logiciel biostatique et graphique. Effectuer l&#39;analyse de régression non linéaire pour déterminer les valeurs de la CE 50 et CC 50. </li></ol>

<ol>
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Methods. 179, 396-401 (2012).</li><li>Kampmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+screening+of+small+molecule+libraries+using+the+dengue+virus+envelope+E+protein+has+identified+compounds+with+antiviral+activity+against+multiple+flaviviruses.">In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses.</a> Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).</li><li>Kirchmair, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+anti-viral+agents+using+molecular+modeling+and+virtual+screening+techniques.">Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques.</a> Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Pour l&#39;identification initiale des résultats antiviraux, l&#39;une des étapes clés pour la découverte de médicaments antiviraux et de développement est de développer des tests robustes, qui comprend la sélection d&#39;un marqueur quantifiable, l&#39;élaboration d&#39;un protocole simple, obtenir suffisamment de signaux et moins de 10% CV. La plupart des écrans biochimiques ou cellulaires sont conçus pour fournir un point de départ chimique sur la base du plus robuste, un test simple et peu coûteux, en r...

BTV est un virus à ARN double brin prototype dans le genre Orbivirus, famille Reoviridae. BTV est une des maladies les plus importantes de bétail domestique, y compris les ovins, les caprins, les bovins et d&#39;autres animaux domestiques, avec une perte $ 3000000000 / année dans le monde 1,2. Le sérotype BTV exotique est un agent pathogène important animale énumérés dans les &quot;USDA Haute Conséquence agents pathogènes du bétail.&quot; Récemment, la ré-émergentes de BTV a causé une épidémie majeure de la maladie chez les bovins et les moutons dans plusieurs pays d&#39;Europe du Nord 3,4. En raison de son importance économique et en tant que système modèle, BTV a fait l&#39;objet d&#39;études moléculaires, génétiques et structurales étendues, et plusieurs vaccins ont été mis au point. Toutefois, en raison de l&#39;absence de tests adéquats pour la découverte de médicaments antiviraux, il n&#39;y a pas d&#39;antiviraux disponibles contre la maladie. Dans un récent criblage à haut débit (HTS) de la campagne en utilisant BTV comme système modèle, nous Developed, optimisé et validé un test basé sur CPE à identifier des antiviraux à large spectre contre les arbovirus potentiels 5. Dosage à base de CPE est un test bien connu qui a été utilisé dans la découverte de médicaments antiviraux contre un certain nombre de virus qui induit rapide et observable CPE / apoptose 5-7. Dans notre système, après l&#39;infection virale, CPE est évident dans les cellules de vertébrés, y compris les cellules HeLa, BSR, et HEK 293T 8. CPE BTV-induite peut être surveillée et quantifiée à l&#39;aide de divers procédés de détection de la viabilité cellulaire, y compris le kit de réactifs de viabilité cellulaire CellTiter Glo (kit CTG) 9. Cet ensemble détermine le nombre de cellules viables dans la culture sur la base de la quantification de l&#39;ATP cellulaire présenté, ce qui signale la présence de cellules vivantes métaboliquement actives. Dans des conditions optimisées, le dosage à base de CPE-présentée ici a montré sa faisabilité avec le &quot;mélanger et mesurer&quot; protocole en une étape, et la flexibilité avec des signaux luminescents stables. Pendant ce temps, les composés toxiques Reducement viabilité cellulaire sera exclu de cette analyse à base de CPE. Le dosage à base de CPE-a montré sa robustesse et sa fiabilité pour antivirale découverte de médicaments contre la maladie, et a été utilisé pour cribler des bibliothèques moléculaires référentiel NIH petites molécules (MLSMR), ce qui conduit à l&#39;identification de six nouveaux groupe de potentiel antiviral composé de plomb (s ) 5. Quand un composé antiviral potentiel a été identifié en utilisant l&#39;essai à base de CPE, il devra être soumis à l&#39;essai dose-réponse dix-concentration pour déterminer la plage d&#39;efficacité antivirale et la cytotoxicité 2. L&#39;efficacité antivirale, représentée comme la concentration inhibitrice 50% (CI 50), soit la concentration efficace 50% (EC50) est la concentration d&#39;un médicament qui inhibe la CPE à mi-chemin viro-induite entre la ligne de base et au maximum. La cytotoxicité des antiviraux, c&#39;est à dire la concentration de la cytotoxicité de 50% (CC 50), est la concentrationd&#39;un médicament induisant une cytotoxicité de 50% entre la ligne de base et au maximum. L&#39;indice sélectif (SI), noté 50% SI (SI 50) est calculée à partir de CC 50 / IC 50 qui détermine la spécificité de la antivirale contre le CPE induit par un virus. La CI 50 (ou 50 CE), CC 50 et SI 50 valeurs sont des mesures essentielles pour déterminer si un composé antiviral est puissant et sélectif pour la poursuite du développement de médicaments. Quand un antiviral n&#39;a montré aucune toxicité manifeste in vitro, encore empêché virus induit CPE et le cycle de vie virale productive, il est important de caractériser son mode d&#39;action 2. Nous avons lancé cette qualification en réalisant essai ToA pour déterminer l&#39;étape possible (s) de cycle de vie viral qui est affecté par l&#39;antiviral. En général, composé antiviral ont été ajoutés à des cellules à différents moments pré-ou post-infection virus. Si les antiviraux ont été ajoutés à des cellules infectées poster à son objectif detep au cours de l&#39;infection, il en résulterait une activité plus faible par rapport à celle qui a été ajoutée avant l&#39;étape. Ainsi, l&#39;étude ToA est critique pour la détermination de l&#39;efficacité antivirale d&#39;un composé, et sa cible potentielle, soit sur le cycle de vie viral ou la machinerie de l&#39;hôte impliquées dans le cycle de vie viral. Pour les trois essais, la viabilité cellulaire a été déterminée en utilisant le kit CTG suivant les instructions du fabricant 5. Ce système de détection émet des signaux de luminescence adéquates qui pourraient être analysés à l&#39;aide de divers logiciels en interne. Chaque essai a été validé et effectué au moins en triple exemplaire avec huit répliques. Pour l&#39;ensemble des données obtenues, trois paramètres, y compris la valeur moyenne (AVE), l&#39;écart type (STDEV), et coefficient de variation (CV) ont été analysés afin de déterminer la robustesse de l&#39;analyse. Une fois la robustesse de l&#39;analyse a été déterminé, les données seront analysés et obtenues en utilisant différents biostatistique et graphiquementdes outils de c 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1134218</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1000185</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gbico</td>
			<td>1049769</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>TB288</td>
			<td>For cell viability measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25309B</td>
			<td>Diluted from 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiviral huashilcompounds</td>
			<td>NIH MLSMR and de novo synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTV-10</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSR cell</td>
			<td>Developed in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For luminescent signal reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFlo select dispenser</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Adding cells, virus, and reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom microplate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>28908031</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen. 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 5</td>
			<td>For biostatic analysis and plot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the identification of novel antivirals against bluetongue virus

Pour identifier les antiviraux potentiels contre BTV, nous avons développé, optimisé et validé trois essais présentés ici. L&#39;essai à base de CPE-a été le premier essai mis au point pour évaluer si un composé a montré une quelconque efficacité antivirale et ont été utilisés pour cribler grande bibliothèque de composés. Pendant ce temps, la cytotoxicité des antiviraux pourrait également être évaluée en utilisant le test basé CPE. L&#39;analyse dose-réponse a été conçu pour déterminer la plage de l&#39;efficacité de l&#39;antiviral choisi, c&#39;est à dire 50% de la concentration inhibitrice (CI 50) ou la concentration efficace (CE 50), ainsi que sa gamme de cytotoxicité (CC 50). Le dosage ToA a été utilisée pour l&#39;étude initiale MoA pour déterminer le mécanisme sous-jacent des nouveaux antiviraux pendant BTV cycle de vie viral ou l&#39;effet possible sur la machinerie cellulaire de l&#39;hôte. Ces dosages sont vitales pour l&#39;évaluation de l&#39;efficacité antivirale dans un système de culture cellulaire, et ont été utilisés pour conduire nos recherches récentesment à l&#39;identification d&#39;un certain nombre de nouveaux antiviraux contre BTV.

Une. Efficacité antivirale du composé Le dosage de la CPE à base de cellules a été développé, optimisé et validé in vitro en utilisant le kit CTG base luminescente à identifier de nouveaux antiviraux contre la maladie, comme décrit précédemment 2,5. Le dosage de la réponse dix-dose a été utilisée pour tenir compte de l&#39;efficacité antivirale et la cytotoxicité d&#39;un composé de plomb identifiés en mesurant le nombre de cellules métaboliquement viab...

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Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Trois essais, y compris l&#39;effet cytopathique (CPE) à base de test, essai dose-réponse et (TOA) test à temps de Addition ont été développés, optimisés, validés et utilisés pour identifier de nouveaux antiviraux contre le virus de la fièvre catarrhale (BTV), ainsi à déterminer le Mécanisme d&#39;action-de-possible (MOA) pour antiviraux nouvellement identifiés.

Les tests pour l&#39;identification de nouveaux antiviraux contre la fièvre catarrhale Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

assays-for-identification-novel-antivirals-against-bluetongue

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.9K vues.  University of Alabama at Birmingham.  Trois essais, y compris l'effet cytopathique (CPE) à base de test, essai dose-réponse et (TOA) test à temps de Addition ont été développés, optimisés, validés et utilisés pour identifier de nouveaux antiviraux contre le virus de la fièvre catarrhale (BTV), ainsi à déterminer le Mécanisme d'action-de-possible (MOA) pour antiviraux nouvellement identifiés. 

Vidéo: Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Détermination de la concentration virale par Plaque Essais: Systèmes calque à l&#39;aide traditionnels et nouveaux

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Recherche

Immunologie et infection

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Immunofluorescence de suivi de l&#39;absorption cellulaire de la lactoferrine humaine et de son activité associée antivirale contre le virus de l&#39;hépatite C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Early Viral entrée dosages pour l&#39;identification et l&#39;évaluation des composés antiviraux

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Les analyses qualitatives et quantitatives pour la détection et la caractérisation des antimicrobiens en protéines

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Évaluation de l&#39;efficacité et la toxicité des ARNs Ciblage VIH-1 Production pour utilisation en thérapie génique ou des médicaments

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

Développement et identification d&#39;une sous-population Novel of Human neutrophiles dérivé phagocytes géant<em&gt; In vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basées sur la fluorescence neuraminidase Essai d&#39;inhibition pour évaluer la sensibilité des virus de la grippe à la neuraminidase Inhibiteur Classe de Antiviraux

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Dépistage des essais pour caractériser les nouveaux régulateurs endothéliales impliqués dans la réponse inflammatoire

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Extraction rapide, sûre et Simple acide nucléique chevet manuelle pour la détection des Virus dans des échantillons de sang total

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

Identification de codage et de Classes d’ARN Non codants exprimée chez le porc sang total

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...