We thank Eliq Oster for the images of the Bacillus subtillis. The work is supported by the European Research Council (# 260871) and the Israel Science Foundation (#592/10).

1. Construire le programme d&#39;installation <ol><li> Choisissez un scanner à plat, résolution optique: 4800 dpi; Résolution de matériel: 4800 x 9600 dpi; couleur profondeur de bits: 48 bits, qui peut fonctionner à des niveaux de température et d&#39;humidité pertinents. </li><li> Boîtes de Pétri ont un volume important, contrairement au papier habituellement utilisé sur les scanners commerciaux. Les colonies se situent au-dessus de la couche de gélose, d&#39;environ 5 mm au-dessus de la surface du scanner. Remarque: Pour la plupart des scanners les colonies seront mis au point. </li><li> Certaines entreprises du scanner ne permettent pas la connexion de plus d&#39;un exemple de scanner du même type sur le même ordinateur. Assurez-vous que plus d&#39;un scanner peut être attaché et identifié de manière unique. </li><li> Préparer les accessoires tels que détaillés ci-dessous: <ol><li> Préparer des morceaux de feutrine noire stérile pour couvrir les plaques (figure 1 étape 2). </li><li> Pour tenir les boîtes de Pétri en place, préparer les détenteurs de plaques blanches (Matériels et méthodes) qui correspondent aux scanners et qui ont 6 holes de la taille des plats (figure 1 de l&#39;étape 3). </li></ol></li><li> Si nécessaire pour la croissance du micro-organisme, mettre les scanners dans un environnement à température contrôlée. Connectez les scanners à l&#39;ordinateur. </li><li> Facultatif: Connectez le relais à l&#39;ordinateur et de contourner l&#39;interrupteur marche / arrêt du scanner à surmonter gradient de température. NOTE: L&#39;unité de relais est pour les micro-organismes extrêmement sensibles à la température. Il s&#39;éteint le scanner de sorte que l&#39;électronique ne chauffent pas la surface inégale. En utilisant seulement une partie de la surface du scanner peut obtenir des résultats similaires. </li></ol> 2. Installez le Gestionnaire de numérisation <ol><li> Copiez tous les fichiers de l&#39;application &quot;Gestionnaire de numérisation&quot; dans un répertoire désigné de http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html. </li><li> Configurez fichier ScanningManager.exe.config selon les noms des scanners telles qu&#39;elles apparaissent dans Management-&gt; Gestionnaire de périphériques-&gt; Périphériques d&#39;images informatiques ( <strong&gt; Figure 2). </li><li> Pour le dépannage de l&#39;application &quot;Gestionnaire de numérisation», voir le fichier lisez-moi. </li><li> Pour la documentation sur l&#39;application &quot;Gestionnaire de numérisation», voir Documentation.html. </li></ol> 3. Réaliser une expérience <ol><li> Préparer les boîtes de Pétri (figure 1): <ol><li> Diluer la culture à environ 2000 CFU / ml. Plate 0,1 ml de culture de manière uniforme sur la surface de la plaque. </li><li> Pour obtenir un bon contraste entre les colonies et le plat et à absorber l&#39;humidité, couvrir la plaque avec un morceau de feutrine noire stérile. Mettre le couvercle sur la plaque. </li></ol></li><li> Placer les plaques dans les supports sur les scanners. </li><li> Démarrez le Gestionnaire de numérisation (Figure 3): Choisissez les scanners participants de la liste des scanneurs connectés. Choisissez le nombre d&#39;images à prendre (répétitions), l&#39;intervalle de temps entre les images suivantes (l&#39;écart du temps), et le délai d&#39;attente avant de commencer til expérimenter (démarrer après). </li></ol> 4. L&#39;analyse des images REMARQUE: Un aperçu des méthodes de calcul est prévu pour analyser les images en utilisant MATLAB &quot;ScanLag&quot;, qui est disponible gratuitement pour un usage non-commercial à http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications. html. Autres fonctions disponibles sont décrites dans le manuel du logiciel, et un exemple de code est complété. <ol><li> Trier les images de chaque scanner dans des dossiers séparés. </li><li> Utilisation de la fenêtre de commande de Matlab, exécutez les procédures suivantes. Les paramètres requis pour exécuter ces procédures sont définies dans le manuel du logiciel. <ol><li> Exécutez PreparePictures pour effectuer un prétraitement: En pré-traitement, les images d&#39;un scanner sont alignés. Chaque boîte de Pétri est rognée de chaque séquence d&#39;images. L&#39;heure à laquelle chaque image a été recueilli est récupérée à partir de l&#39;horodatage. </li><li> TLAllPlates Exécuter pour exécuter la détection et le suivi en ehaque plat Petri séparément, les colonies sont détectés et attribuer un numéro d&#39;identification. </li><li> L&#39;analyse des données extraites: Les tailles de chaque colonie détectée est mesurée en fonction du temps. Pour extraire la distribution de l&#39;apparence des colonies utiliser les fonctions suivantes dans la fenêtre de commande de Matlab (des informations complémentaires sont disponibles dans le manuel du logiciel): <ol><li> Exécutez ScanLagApp pour afficher l&#39;analyse d&#39;un certain côté boîte de Pétri avec le graphique des colonies dimensionner en fonction du temps (figure 4). <ol><li> Utilisez le curseur pour modifier l&#39;heure de la plaque. Le moment est également indiquée par une ligne verticale correspondant sur le graphique de la zone de colonies. </li><li> Cliquez sur une colonie de voir sa courbe associée, et vice versa, cliquez sur une courbe de trouver sa colonie associé. Après identification de la colonie, le phénotype peut être récupéré par la cueillette de la colonie de la boîte de Pétri identifié. </li><li> Filtrer les défauts de l&#39;analyse automatique par choochanter une colonie et en cliquant sur le bouton exclure. En cliquant exclure le numéro de la colonie devient jaune. </li></ol></li><li> Après être passé par les résultats de l&#39;analyse de chaque plaque, résumer les résultats: <ol><li> Exécutez AddHistograms pour créer un histogramme des temps d&#39;apparence. </li><li> Exécuter plotDeathCurve pour créer une représentation de la courbe de survie de la distribution. </li><li> Exécutez GetAppearanceTimes pour obtenir le temps d&#39;apparition de toutes les colonies dans l&#39;expérience. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+stress+on+individual+lag+time+distributions+of+Listeria+monocytogenes.">Influence of stress on individual lag time distributions of Listeria monocytogenes.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 2940-2948 (2005).</li><li>Metris, A., George, S. M., Peck, M. W., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+turbidity+detection+times+produced+by+single+cell-generated+bacterial+populations.">Distribution of turbidity detection times produced by single cell-generated bacterial populations.</a> Journal of Microbiological Methods. 55, 821-827 (2003).</li><li>Balaban, N. 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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence:+mechanisms+for+triggering+and+enhancing+phenotypic+variability.">Persistence: mechanisms for triggering and enhancing phenotypic variability.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 21, 768-775 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Méthodes microscopiques basées sur l&#39;observation directe sont souvent considérés comme la «norme d&#39;or» pour étudier le comportement de cellule unique. ScanLag, ce qui permet la mesure de la distribution des temps de latence dans les populations bactériennes, fournit des données en bon accord avec la distribution obtenue à partir de l&#39;analyse à cellule unique et permet d&#39;obtenir des statistiques beaucoup plus élevées. Plusieurs étapes critiques doivent être effectuées pour que cette méthode fonctionne bien: d&#39;abord, ne pas transiger sur la résolution du scanner, qui devrait être de 4800 x 9600 pour obtenir de bonnes images. Deuxièmement, être conscient que sans le module de gestion de l&#39;alimentation (étape 1.6), le gradient de température peut se développer sur la surface à plat et affecter la croissance. Une autre étape importante est la filtration de défauts tels que des poussières qui peuvent avoir été comptées à tort comme des colonies par le logiciel. La soustraction de fond intégré du logiciel surmonte généralement ces défauts, mais les colonies parfois «faux» ont pourfiltrer manuellement. Les principales étapes de dépannage peuvent répondre à la variation inter-plaque dans la configuration, pour plusieurs raisons: (a) Le taux de micro-organismes de la croissance est affectée par la température. Différentes conditions de température et d&#39;humidité peuvent se produire en raison de la ventilation inégale ou l&#39;emplacement de l&#39;antenne dans l&#39;incubateur. (B) L&#39;électronique du scanner peuvent chauffer et provoquer un gradient de température à travers la surface du scanner. Figure 10 montre l&#39;influence d&#39;un tel gradient thermique spatiale sur les bactéries du genre Bacillus, en même temps que les mesures de la température sur la surface de balayage avant et après mise en oeuvre du module de gestion de l&#39;alimentation (étape 1.6). A noter que ce module peut ne pas être nécessaire pour les scanners les plus récents, et si seule une partie de la surface du scanner est utilisé, la gestion d&#39;énergie peut être inutile. (C) Plaques avec différents opacité de la gélose nutritive pourrait mener à différents niveaux de détection. Figure 11 montre èmee pour la tolérance aux différents volumes de gélose nutritive qui se traduisent par des opacités différentes. Expérimentalement la technique de ScanLag est facile à réaliser et ne nécessite que la plaque de micro-organismes sur des boîtes de Pétri standard et pour les placer sur la surface de l&#39;analyseur. Le logiciel qui a été développé commande l&#39;ensemble de la procédure. L&#39;acquisition des images se fait automatiquement, et l&#39;analyse d&#39;image pour le suivi des colonies est également automatique. En outre, le système peut être adapté en place pour mesurer de nombreuses conditions différentes en même temps. Enfin, la méthode repose sur les scanners de bureaux commerciaux et, par conséquent, est à faible coût. Cette technique peut être étendue à l&#39;étude des micro-organismes qui sont différentes de E. coli K-12, mais plusieurs considérations doivent être faits. Tout d&#39;abord, l&#39;influence des premières colonies apparaissant sur ​​les plus tardives doit être évaluée, comme décrit en détail dans une publication précédente 7. Pour E. Coli K-12, l&#39;densité maximale de UFC par plaque est de 200. D&#39;autres souches de différentes tailles de colonies, et d&#39;autres possible diaphonie entre les colonies, pourrait exiger une densité différente. Deuxièmement, l&#39;analyse des plaques est calibré à des seuils de logiciels basés spécifiques qui pourraient avoir besoin d&#39;être modifié, en fonction du contraste entre le support solide et les colonies. Le logiciel peut aussi être étendue pour extraire d&#39;autres caractéristiques de la colonie, au-delà de retard et le taux de croissance. Le code de logiciel est ouvert et peut être modifiée pour en extraire la forme de colonies, la luminosité, la couleur et la douceur. Parce que les mesures sont faites sur les colonies qui proviennent de cellules individuelles, les données révèlent de nouveaux phénotypes qui ne peuvent pas être mesurés par des mesures au niveau de la population. L&#39;importance de la distribution des temps de latence est révélé en présence d&#39;antibiotiques. Beaucoup d&#39;antibiotiques sont connus pour être efficaces seulement contre les cellules en croissance; Par conséquent, tant que les cellules restent dans la phase de latence et ne se développent pas, elles sont proprotégés contre les effets de ces antibiotiques 21. Lorsque le nombre de bactéries survivant sont évaluées à des intervalles de temps au cours du traitement antibiotique 15,22,23, une sous-population de bactéries, appelé persistants, est souvent révélée. Dans certains cas, l&#39;immunité à un traitement antibiotique prolongé provient du décalage. En utilisant cette configuration, ce retard est révélé et a souvent une distribution non-trivial 24 (figure 6). Ce procédé permet également la récupération de mutants rares. Par exemple, après le placage d&#39;une population ayant subi une mutagenèse, les mutants peuvent être identifiés en se basant sur le phénotype et isolés directement, sans sélection. La configuration peut également surveiller les interactions cellule-cellule en mesurant la croissance des colonies en fonction de la densité des colonies voisines et de quantifier les phénomènes tels que la détection de quorum ou la propagation des bactéries essaimage. Informations multidimensionnelles découvert par les expériences futures en utilisant cette méthode mènera à une meilleure caractérisation de la population microbiennes et aux progrès de la recherche médicale et de l&#39;environnement.

Les bactéries ont évolué pour répondre à de nombreuses conditions stressantes. Une caractéristique générale de l&#39;adaptation au stress est un changement dans la dynamique de croissance de 1,2. dynamique de croissance se caractérisent essentiellement par deux paramètres: le taux de croissance exponentielle et le temps de latence, à savoir le temps nécessaire pour s&#39;adapter aux nouvelles conditions. Attendu qu&#39;un grand nombre de méthodes à haut débit se concentrer sur des mesures de la vitesse de croissance, le temps de latence est souvent un paramètre vis à vis, bien qu&#39;il soit le paramètre essentiel pour la caractérisation de l&#39;adaptation à des conditions nouvelles. Quantification de l&#39;adaptation aux conditions changeantes a toujours été effectuée en utilisant des méthodes manuelles laborieuses 3,4. Plus récemment, des techniques de pointe ont été mis au point pour l&#39;analyse de cellules uniques 5,6. Cependant, il est encore difficile de faire la distinction croissance normale suite à un retard de croissance (à savoir un temps de retard) à partir de 2,3 croissance lente. Procédé automatisé a été construit, ScanLag 7, àla distinction entre ces deux phénotypes similaires. Un exemple frappant de l&#39;importance de l&#39;étude de la distribution des temps de latence est révélé sous traitement antibiotique. Antibiotiques et d&#39;autres contraintes Beaucoup tuer les cellules en croissance active seulement, et, par conséquent, les cellules qui sont &quot;en&quot; sont protégés 8. Pour surveiller le temps de latence, on peut observer des cellules individuelles sous un microscope et de surveiller le temps de première division. Un inconvénient majeur de cette méthode est que l&#39;intervalle de temps dynamique est limité; les cellules qui se développent au début couvrent la surface à une vitesse exponentielle, ce qui diminue efficacement la croissance des cellules avec un plus long temps de latence. L&#39;utilisation de chambres d&#39;écoulement contourne quelque peu cette 5, mais un nombre limité de cellules peut être suivi et la fraction des bactéries qui sortent de la phase de latence après que la majorité de la population a commencé à croître ne peut être observée. En dépit de ces limitations, plusieurs études ont évalué l&#39;influence du niveau de différentes insiste sur la distribution du temps de retard en utilisant la microscopie de cellules isolées 9-12. Une autre façon de surveiller la distribution des temps de latence se fait par des mesures de turbidité 13,14. Beaucoup de cultures parallèles, chacun a commencé à partir d&#39;une seule cellule, sont cultivées dans un lecteur de densité optique qui mesure le nombre de bactéries dans la culture au fil du temps. Cette méthode est limitée par la précision de l&#39;extrapolation et pour le nombre de puits dans une plaque. Procédé automatisé a été développé, appelé ScanLag, qui permet des temps de retard et les distributions des temps de croissance doit être évaluée, même pour le petit pourcentage de bactéries dans une population et ayant des temps de latence très long. La méthode est basée sur la détection de colonies sur des plaques de gélose nutritive classiques 15 (figure 1). Pour automatiser la détection 16,17 une gamme de scanners commerciaux 18 qui sont dirigés par des logiciels maison pour acquérir périodiquement des images des plaques, a été conçu. Logiciel a étéconçu pour analyser automatiquement les images et extraire des paramètres quantitatifs 19,20, telles que le temps d&#39;apparition de chaque temps de chaque colonie, qui est défini ici comme le temps de se développer à partir de 20 pixels à 80 pixels et la croissance des colonies. Ici, nous présentons le procédé en détail, y compris la configuration du système et l&#39;utilisation du logiciel automatisé d&#39;analyse d&#39;image qui a été amélioré avec une meilleure interface utilisateur. Cette méthode peut être adaptée pour mesurer d&#39;autres caractéristiques des colonies, tels que la morphologie et la couleur. La mesure de ces types de paramètres permet l&#39;utilisation du système dans phénomique multidimensionnels. Comme la méthode détecte colonies de cellules individuelles, le système peut révéler de nouveaux phénotypes qui ne peuvent être mesurés par des mesures au niveau de la population. La technique permet la détection et la récupération des variantes rares, et facilite le dépistage des caractéristiques souhaitées.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Material</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacto Agar</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Difco LB broth</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish 90mm</td>
			<td style="width:71px;">Miniplast</td>
			<td style="width:119px;">20090-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Epson Perfection v37</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B207201</td>
			<td style="width:167px;">Flatbed Scanner with Optical resolution: 4800 dpi, Hardware Resolution:&#160;4800 x 9600 dpi, color bit depth 48-bit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epson Perfection v200</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B188011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epson Perfection 3490</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B177011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ADU200 USB Relay</td>
			<td style="width:71px;">ONTRAK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">pieces of sterile black felt cloth</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>approximatly 100 x100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">white plate holders</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surface size, with 6 x 99mm diameter hole</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Delerin rings the size of the Petri dish</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">inner diameter: 72 mm 
			outer diameter: 86 mm 
			top outer diameter: 90 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scanlag: high-throughput quantification of colony growth and lag time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

A titre d&#39;exemple d&#39;extraction de distribution de temps de latence, la figure 5 montre la capacité de ScanLag pour identifier et suivre chaque colonie avec des caractéristiques spécifiques sur une plaque avec le temps, comme on le ferait dans un essai de criblage. Lorsque la culture du micro-organisme est hétérogène, les différentes sous-populations peuvent se révéler lors de l&#39;essai. Par exemple, la figure 6 représente la quantification de l&#39;apparence et révèle la distribution des temps de latence bimodale dans une souche mutante de E. ainsi coli. Le taux de croissance des cellules influence le temps de l&#39;apparence de la colonie. Lorsque les colonies se développent à la même vitesse, l&#39;apparition tardive peut être attribuée à la durée de retard (Figure 7). Pour valider la méthode en effet de mesurer le temps de retard de cellules individuelles, on a comparé les résultats de la ScanLag avec ceux obtenus en utilisant la microscopie à cellule unique; cette validation est described en détail dans une publication précédente 7. Cette méthode permet de surveiller beaucoup plus de cellules que peut être évaluée par microscopie. Les distributions obtenues en utilisant la microscopie et obtenu à l&#39;aide ScanLag chevauchent largement. La distribution de ScanLag est légèrement plus large; Des analyses théoriques prévoient l&#39;élargissement à être de l&#39;ordre de l&#39;écart type du temps de division. Si le temps de croissance est différente pour chaque souche, l&#39;origine du retard dans l&#39;apparence doit être examinée plus en utilisant d&#39;autres méthodes. L&#39;influence des premières colonies apparaissant sur-l&#39;apparition de colonies a été examiné plus tard. Des expériences de contrôle ont confirmé que sept apparence n&#39;a pas été affectée par la suite, tant que le nombre total de colonies par plaque ne dépasse pas 200 (figure 8). Une autre expérience de contrôle a confirmé que l&#39;emplacement de la colonie sur la plaque n&#39;affectait pas son temps d&#39;apparition 7. L&#39;analyse de la pLates est calibré pour des seuils spécifiques qui pourraient avoir besoin de modification en fonction de nutriments présents dans le milieu de croissance ou du type de micro-organisme. Néanmoins, l&#39;analyse est assez robuste pour une grande gamme de seuils conformément à la figure 9. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. Un schéma des étapes nécessaires pour créer une distribution de l&#39;apparence de la colonie. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2. Une capture d&#39;écran du gestionnaire de périphériques indiquant les noms des scanneurs connectés, et du fichier de configuration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/5456/51456fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande</a>version de ce chiffre. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3. Une capture d&#39;écran du gestionnaire de numérisation. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4. Une capture d&#39;écran de la ScanLagApp. Une image de la plaque est le volet de gauche, et les courbes de chaque colonie de croissance sont sur ​​le volet de droite, comme indiqué dans le manuel. Les pointes dans certaines des courbes de la zone des colonies se produisent lorsque deux ou plusieurs colonies se confondent. Lors de la fusion des colonies se produit, la surface de ces colonies est considérée comme la zone du joint. <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig5highres.jpg" width="500" /> Figure 5. Un résultat représentatif de l&#39;analyse d&#39;une plaque (A). Une image de la sortie de l&#39;application de la détection à la fin de l&#39;expérience. Chaque zone de colonie est identifié, et de couleur assignée à un numéro d&#39;identification unique. Les flèches indiquent les colonies représentatives mesurées dans B. La colonie est détecté sur la base seuil d&#39;intensité (Pour colonies de E. coli sur gélose LB ou gélose M9 ce seuil est de 0,03. Pour les autres médias ou des bactéries, ce seuil peut être réglé dans les ProcessPictures de fonction ). Seuls les objets de plus de 10 pixels sont comptés (ce seuil peut être modifié dans les MatchColonies de fonction). Détection d&#39;une colonie commence à environ 10 5 bactéries. (B) Terrains de la zone en pixels par rapport au temps de quatre colonies représentatives de cette plaque. Le «temps d&#39;apparition» de chaque colonie, c&#39;est quand la colonie est détecté. Le «temps de croissance» de chaque colonie est défini ici comme le temps de grandir vientm 20 pixels à 80 pixels (ces limites sont réglables à l&#39;aide de la fonction getAppearanceGrowthByVec). Le logiciel exclut les colonies qui ont fusionné avant d&#39;atteindre la limite supérieure. Identification d&#39;une colonie spécifique en fonction de ses caractéristiques est facile grâce à la numéro d&#39;identification et la couleur attribuée à chaque colonie. Par exemple les colonies n ° 1, 56, 77 et 124 sont mises en évidence dans les deux graphiques. <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig6highres.jpg" width="500" /> Figure 6. Aspect quantification peut révéler la distribution des temps de latence bimodale. Comparaison des histogrammes de l&#39;analyse de ScanLag des temps d&#39;apparition pour les deux souches différentes. Ligne bleue: souche de type sauvage en croissance exponentielle (Total: 1320 colonies); rouge mutant de persistance ligne à grande enrichi avec des bactéries en retard (au total: 1 529 colonies). (A) des histogrammes d&#39;apparence normalisés. Le picd&#39;apparition de cellules en croissance exponentielle est le temps typique de croître à une colonie détectable. Encart: même histogramme de la souche mutante après soustraction de la durée du pic de la culture exponentielle pour obtenir le temps de retard réel sur les bacs de journaux interligne montrant la distribution des temps de latence bimodale. (B) Fonction de survie des mêmes données que dans (A) sur une échelle logarithmique. Cette représentation améliore l&#39;aspect de la fin de la queue de la souche mutante. <img alt="Figure 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" width="500" /> Répartition Figure 7. Aspect et distribution du temps de croissance. (A) et (B) montrent deux histogrammes dimensionnelles du temps d&#39;apparition et la durée des deux conditions différentes (Le logiciel exclut les colonies qui ont fusionné avant d&#39;atteindre la limite supérieure) de croissance. (C) comparaison des histogrammesdes deux souches montrent la différence de temps d&#39;apparition, tandis que les temps de croissance (D) sont similaires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig8highres.jpg" width="500" /> Figure 8. L&#39;apparition des premières colonies n&#39;interfère pas avec l&#39;apparition de colonies ultérieures. (A) traîne la distribution temporelle des cellules de type sauvage plaquées seul. (B) la distribution des temps de retard d&#39;une souche sensible au froid seul, après transfert à la température permissive. (C) lag distribution de temps de deux souches plaqués ensemble dans les mêmes conditions. La ligne noire représente la distribution attendue sur la base des données obtenues lors de la mesure de chaque souche séparée. Un boncco rd entre les distributions attendues et mesurées est obtenue à condition que le nombre total de colonies par plaque est inférieur à 200. <img alt="Figure 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig9highres.jpg" width="500" /> .. Figure 9, le seuil de détection n&#39;affecte pas la forme de la distribution de l&#39;apparition de colonies La distribution de l&#39;apparence de la colonie a été analysé pour le même ensemble de données à l&#39;aide de deux tailles différentes de seuil; (A) taille de seuil est de 10 pixels; (B) la taille de seuil est de 50 pixels. Nombre de cellules par histogramme: env. 1500. Le seuil de détection différent en résulte que dans un décalage de la durée de détection. <img alt="Figure 10" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig10highres.jpg" width="500" /> Figure 10. Température mesures de stabilité across surface de scanner. (A) l&#39;image d&#39;une plaque avec des colonies de Bacillus subtilis cultivés sur le scanner sans gestion de l&#39;alimentation. La surface est plus chaud sur la partie inférieure et par conséquent, les colonies se développent plus rapidement. La ligne progressive à côté de la plaque est une représentation schématique du gradient thermique. (B) La stabilité thermique a été mesurée à l&#39;aide de deux thermocouples placés sur la surface de l&#39;analyseur. Le scanner chauffe pendant chaque balayage et dans le temps. (C) avec gestion de l&#39;alimentation, la température est uniforme et les colonies croître à des taux similaires. (D) Identique à (B) avec le module de gestion de l&#39;alimentation. stabilité de température de ± 0,2 ° C. <img alt="Figure 11" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig11highres.jpg" width="500" /> Figure 11. Différences dans la répartition de l&#39;aspect peuvent être dus à differences dans les volumes de milieu solide. La même culture bactérienne a été étalée sur des plaques avec différents volumes de la gélose LB, qui donne une hauteur différente de la surface de la gélose. Les différentes hauteurs différentes ont conduit à l&#39;opacité des plaques, et donc un temps de détection différent. La différence entre les plaques a été vérifiée et la différence entre les différentes conditions de hauteur. (A) les différences typiques entre les plaques de volumes égaux de 30 ± 0,5 ml de gélose LB. (B) Différence entre les différentes conditions de taille: la distribution de l&#39;apparence a été mesurée pour les plaques avec des volumes de 20 ± 0,5 ml (rouge), de 30 ± 0,5 ml (vert) et de 40 ± 0,5 ml (bleu). Chaque condition est la moyenne des six plaques différentes. Tant que le volume des plaques se situe dans une plage de ± 5 ml, l&#39;opacité est semblable et conduit à une distribution de temps d&#39;apparition similaire.

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ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag: haut débit Quantification de Colony croissance et décalage

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

scanlag-high-throughput-quantification-of-colony-growth-and-lag-time

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.0K vues.  The Hebrew University of Jerusalem. ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

Vidéo: ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Recherche

Immunologie et infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Criblage à haut débit pour à large spectre inhibiteurs chimiques de l&#39;ARN virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Scalable High Throughput sélection à partir de bibliothèques d&#39;anticorps synthétiques phage

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Haut-débit quantitative en temps réel RT-PCR analyse pour déterminer les profils d&#39;expression de types I et III sous-types d&#39;interféron

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Haut-débit Gene Tagging dans<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

High Throughput, en temps réel, à double lecture Test de intracellulaires activité antimicrobienne et eucaryotes cytotoxicité cellulaire

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Haut débit mesure de Membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Un haut débit de Shigella-test bactéricide spécifique

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...