Dans la nature, Cas9 est une protéine immunitaire contre les virus envahissants que l’évolution préfère Cas9 avec une spécificité promiscuité qui peut fendre l’ADN viral avec des mutations spontanées. Nous avons construit un système d’évolution artificielle dirigée qui préfère une variante Cas9 optimisée avec une grande spécificité. Les sélections négatives et positives fonctionnent simultanément dans le système de dépistage sniper.
Les variantes Cas9 avec une activité hors cible réduite maintenant également l’activité sur cible peuvent être examinées immédiatement. Des mutations ont été introduites sur l’ensemble de la séquence Cas9 au hasard pour produire la bibliothèque à projeter. Et cela a permis de trouver des mutations dans des positions inattendues.
À l’heure actuelle, de nombreux chercheurs du milieu universitaire et de l’industrie utilisent le Cas9 de type Y pour des développements thérapeutiques. Toutefois, la spécificité de Cas9 de type Y n’est pas optimisée, ce qui peut entraîner des enveloppements serrés. Chez l’homme, cela signifie des mutations inattendues dans les gènes aléatoires, ce qui peut conduire à des effets secondaires graves.
Il existe de nombreux Cas9 comme des enzymes qui sont en cours de développement dans la thérapeutique. Notre technique peut être utilisée pour améliorer la spécificité d’autres ADN et nucléides comme Jipinger, thaïlande, et Cas9 également tels que CPF1. Faire une bibliothèque assez grande est la clé pour augmenter les possibilités d’obtenir une variante avec une fonction importante.
Assurez-vous d’obtenir une efficacité élevée dans l’étape de refroidissement, et d’utiliser des cellules compétentes très efficaces. Pour commencer cette procédure, ajoutez un nanogramme du plasmide CCDB et du plasmide SGRNA avec des inadéquations doubles en cinquante microlitres de cellules BW25141 GOI décongelées. Mélanger délicatement les cellules par pipetage, et les transférer dans une cuvette d’électroporation pré-refroidie de 0,1 centimètre.
Transformez l’E-coli avec les deux plasmides par électroporation. Immédiatement après la fin de l’électroporation, ajouter 250 microlitres de soc moyen. Pipette doucement la solution pour mélanger les cellules et moyen, et transférer le mélange à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.
Récupérez les cellules transformées et incubez-les à 32 degrés Celsius, avec des secousses douces pendant une heure. Continuez à préparer les cellules de criblage Snyper telles que décrites dans le protocole texte. Lorsqu’ils sont prêts à effectuer le criblage Snyper, transformer les cellules de criblage Snyper avec 100 nanogrammes des plasmides de variante Cas9 préparés de chaque bibliothèque en utilisant le processus d’elctroporation qui a été précédemment décrit.
Ensuite, transférez 250 microlitres des cellules dans un tube de microcentrifugeuse frais de 1,5 millilitre. Ajouter 250 picogrammes d’ATC à une concentration finale de 10 nanogrammes par millilitre. Récupérez à la fois les cellules contenant de l’ATC et les cellules exemptes d’ATC en les incubant à 32 degrés Celsius pendant une heure avec de douces secousses.
Plaque 25 microlitres des cellules exemptes d’ATC récupérées sur une plaque d’agar LB, contenant du chloramphénicol et de la kanamycine. Ajouter l’ATC à l’ATC récupéré contenant des cellules à une concentration finale de 100 nanogrammes par millilitre sur une plaque d’agar LB de 245 millimètres. Plaquez immédiatement les cellules contenant de l’ATC sur une agar LB contenant de la plaque contenant du chloramphénicol, de la kanamycine et de l’arabinose.
Incuber toutes les assiettes pendant la nuit à 32 degrés Celsius. Le lendemain, photographiez les assiettes. À l’aide du logiciel CFU ouvert, compter le nombre de colonies viables, en s’assurant que le nombre de colonies sur la plaque non sélective est au moins dix fois plus grand que la diversité de la bibliothèque, pour couvrir toutes les variantes.
Tirez les colonies qui ont survécu sur les plaques sélectives des trois bibliothèques. Transférer ces colonies en commun à 250 millilitres de LB moyen, complétées par du chloramphénicol, et incuber pendant la nuit à 42 degrés Celsius. Tout d’abord, chargez le logiciel Cas of finder pour choisir les sites cibles.
Sélectionnez le type PAM approprié pour le type spécifique de Cas9 et le génome cible. Remplissez l’onglet séquences de requête. Choisissez le numéro d’inadéquation et cliquez sur le bouton soumettre.
Après quelques secondes, les sites cibles et hors cible s’afficheront. En général, choisissez les sites hors cible avec un à trois décalages. Ensuite, commandez les oligos CRRNA et Track RRNA avec des séquences de modèle et amplifiez le modèle tel qu’il est décrit dans le protocole texte.
Analyser deux microlitres de l’ADN du modèle amplifié, sur un gel d’agarose de 2%, puis purifier le modèle. Incuber le mélange de réaction pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, ajouter 0,5 microlitres de DNAse et incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes, puis purifier le SGRNA.
Ensuite, traiter 10 microgrammes de l’ARN transcrit in vitro avec 250 unités de phosphatase alcaline intestinale du veau pendant trois heures à 3 degrés Celsius, en présence de 100 unités d’inhibiteur du RNAse, puis purifier le SGRNA traité. Tout d’abord, maintenir les cellules T HEK293 dans le DMEM complété par 10%FBS et 1% antibiotiques à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, mélangez deux microgrammes de type sauvage ou de protéine Snyper Cas9 avec deux microgrammes de SGRNA, et incubez à température ambiante pendant dix minutes pour faire des complexes RNP.
Essayez et comptez les cellules, puis lavez-les et préparez-les dans le tampon d’électroporation tel que décrit dans le protocole de texte. Électroporer les complexes RNP dans les cellules à l’aide d’une impulsion de 1300 volts pendant 30 millisecondes. Immédiatement après l’électroporation, plaquez les cellules sur une plaque de 48 puits remplie de 500 microlitres de DMEM, complétée par 10% de FBS et 1% d’antibiotiques.
Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Maintenir les cellules T HEK293 dans le DMEM complétées par 10%FBS et 1% antibiotiques à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. La veille de la transfection, trypsiniser et compter les cellules.
Si vous travaillez à une échelle de 48 puits, plaquez 10 000 cellules par puits et 250 microlitres de milieu de croissance complet. À l’aide d’un réaccérateur transfection à base de lipides, préparez 250 nanogrammes de plasmide P3S Cas9 et 250 nanogrammes d’ARN SG pour la transfection. Ensuite, mélangez les plasmides dans 25 microlitres de MEM sans sérum.
Diluer un microlitre de réaccélétration transfection avec 25 microlitres de MEM sans sérum. Incuber ce mélange à température ambiante pendant cinq minutes. Mélanger le mélange de plasmides avec le mélange de réaccfection transfection et incuber à la pièce pendant 20 minutes pour former des complexes de lipofectamine plasmide.
Après cela, ajouter 50 microlitres de ce mélange directement à chaque puits contenant des cellules. Bercer délicatement la plaque d’avant en arrière pour mélanger. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant 48 à 72 heures après la transfection, avant d’apaiser l’expression transgénique.
Après avoir isolé l’ADN génomique précédemment préparé, générer des bibliothèques de séquençage en profondeur par amplification PCR de l’ADN GDNA avec des amorces ciblant la cible et hors cible. Ensuite, utilisez des amorces d’index pour étiqueter chaque échantillon. Utilisez une machine de séquençage de nouvelle génération pour soumettre les bibliothèques de piscine au séquençage final apparié.
Une fois l’écran Snyper effectué, le pourcentage de colonies de survie peut être calculé en divisant le nombre de colonies sur la plaque LB sélective par le nombre de colonies sur la plaque LB non sélective. Bien que ce pourcentage soit généralement très faible lorsqu’il est effectué avec les bibliothèques de SP Cas9, de véritables succès positifs peuvent être enrichis en répétant l’écran avec le pool survivant. Un écran Snyper représentatif montre un taux de survie de 100% est obtenu après le troisième écran.
Les transfections utilisant des PNR ou des plasmides codés Snyper Cas9 peuvent être effectuées pour diverses cibles, et les activités cibles et hors cible qui en résultent sont mesurées par le séquençage amplicon des cibles. Chez la plupart des cibles, Snyper Cas9 affiche le même niveau d’activités cibles et des ratios de spécificité plus élevés par rapport au type sauvage. Les ARNS tronqués peuvent également être utilisés pour améliorer davantage la spécificité.
Une plus grande efficacité de transformation dans la première étape de nettoyage est très importante pour ne pas perdre les clones avec une grande spécificité. Les étapes de dépistage ultérieures reviennent moins d’efficacité de transformation puisque les clones sont déjà enrichis dans la première étape de criblage, et il y a moins de chance de les perdre. Il y aura plus d’un clone que nous avons trouvé dans l’écran Snyper.
Les activités cibles et hors cible de ces clones devraient être caractérisées dans autant de cibles différentes que possible pour sélectionner des clones ayant les meilleures performances. Avec cette méthode, les scientifiques peuvent améliorer la spécificité des enzymes cas9-like sans perte d’activité sur la cible. En outre, les scientifiques n’ont pas besoin de connaissances préalables sur la structure de la protéine pour apporter des améliorations.
