Doğada Cas9, istilacı virüslere karşı, evrimin spontan mutasyonlarla viral DNA'yı kesebilen promiscuous özgüllüğü olan Cas9'u tercih eden bir bağışıklık proteinidir. Yüksek özgüllükte optimize edilmiş bir Cas9 varyantı tercih eden yapay bir yönlendirilmiş evrim sistemi inşa ettik. Sniper Tarama Sistemi'nde hem negatif hem de pozitif seçimler eş zamanlı olarak çalışır.
Hedef dışı aktiviteyi azaltan Cas9 varyantları aynı anda taranabilir. Mutasyonlar tüm Cas9 dizisinde rastgele taranacak kütüphaneyi üretmek için tanıtıldı. Bu da beklenmedik pozisyonlarda mutasyonlar bulmayı mümkün kıldı.
Şu anda, akademi ve sanayi birçok araştırmacı terapötik gelişmeler için Y-tipi Cas9 kullanıyor. Ancak, Y-tipi Cas9 özgüllüğü sıkıca paketlenmiş kapalı neden olabilir optimize edilmez. İnsanlarda, bu rasgele genlerde beklenmedik mutasyonlar anlamına gelir, hangi ciddi yan etkilere yol açabilir.
Terapötik olarak geliştirilen birçok Cas9 enzimleri gibi vardır. Tekniğimiz Jipinger, Tayland ve CPF1 gibi Cas9 gibi diğer DNA ve nükleidlerin özgüllüğünü artırmak için kullanılabilir. Bir kitaplığı yeterince büyük yapmak, önemli işlevlere sahip bir varyant elde etme olanaklarını artırmak için anahtardır.
Soğutma adımında yüksek verimlilik elde etmek ve yüksek verimli yetkin hücreleri kullanmak emin olun. Bu yordamı başlatmak için, çözülmüş BW25141 GOI hücrelerinin elli mikrolitre içine çift uyumsuzluklar ile HEM CCDB plazmid ve SGRNA plazmid bir nanogram ekleyin. Hücreleri boru lar aktarak hafifçe karıştırın ve önceden soğutulmuş, 0,1 santimetrelik elektroporasyon kütütüne aktarın.
Elektroporasyon yoluyla iki plazmidile E-coli dönüştürün. Elektroporasyon tamamlandıktan hemen sonra, 250 mikrolitre SOC ortamı ekleyin. Yavaşça hücreleri ve orta karıştırmak için çözelti pipet ve 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp karışımı aktarın.
Dönüştürülmüş hücreleri kurtarmak ve 32 santigrat derece onları kuluçka, bir saat boyunca hafifçe sallayarak. Metin protokolünde belirtildiği gibi Snyper tarama hücrelerini hazırlamaya devam edin. Snyper taramasını yapmaya hazır olduğunuzda, daha önce açıklanan elctroporasyon işlemini kullanarak her kütüphaneden hazırlanan Cas9 varyant plazmidlerinin 100 nanogramı ile Snyper tarama hücrelerini dönüştürün.
Daha sonra, hücrelerin 250 mikrolitresini taze 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Mililitre başına 10 nanogram lık son konsantrasyona 250 pikogram ATC ekleyin. Atc içeren ve ATC içermeyen hücreleri 32 santigrat derecede hafif çetreleyerek bir saat boyunca hafifçe sallayarak kurtarın.
Kloramfenikol ve kanamisin içeren lb agar plakaüzerinde bulunan atc içermeyen hücrelerin plakası 25 mikrolitre. 245 milimetrelik LB agar plakaüzerinde mililitre başına 100 nanogram lık son konsantrasyona, hücreleri içeren kurtarılan ATC'ye ATC ekleyin. Hemen kloramfenikol, kanamisin ve arabinose içeren bir LB agar içeren bir ATC içeren hücreleri plaka.
Tüm plakaları bir gecede 32 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, plakaların fotoğrafını çek. Açık CFU yazılımını kullanarak, tüm varyantları kapsayacak şekilde, seçici olmayan plakaüzerindeki koloni lerin sayısının kütüphanenin çeşitliliğinden en az on kat daha büyük olduğundan emin olmak için uygun kolonilerin sayısını sayın.
Üç kütüphanenin seçici plakaları üzerinde hayatta kalan kolonileri çekin. Bu havuzlu kolonileri kloramfenikol ile desteklenen 250 mililitre LB ortamına aktarın ve gece boyunca 42 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. İlk olarak, hedef siteleri seçmek için Cas OF bulucu yazılımını yükleyin.
Cas9'un özel tipine ve hedef genomuna uygun PAM Tipini seçin. Sorgu dizileri sekmesini doldurun. Uyumsuzluk numarasını seçin ve gönder düğmesini tıklatın.
Birkaç saniye sonra, hedef ve hedef dışı siteler görünür. Genel olarak, bir ila üç uyuşmazlık olan hedef dışı siteleri seçin. Ardından, CRRNA ve Track RRNA oligolarını şablon dizileriyle sipariş edin ve metin protokolünde belirtildiği gibi şablonu yükseltin.
Güçlendirilmiş şablon DNA'sının iki mikrolitresini %2'lik agarose jel üzerinde analiz edin ve şablonu arındırın. Reaksiyon karışımını bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, 0.5 mikrolitre DNAe ekleyin ve 37 santigrat derecede 15 ila 30 dakika kuluçkaya yatırın ve sonra SGRNA'yı arındırın.
Daha sonra, in-vitro transkripsiyonlu RNA 10 mikrogram tedavi 250 buzağı bağırsak alkalen fosfataz üç saat boyunca 3 santigrat derece, RNae inhibitörü 100 birim varlığında, ve sonra tedavi SGRNA arındırın. İlk olarak, DMEM'deki HEK293 T hücrelerini %10 FBS ve %1 antibiyotiklerle 37 derecede %5 karbondioksitle tamamlar. Daha sonra, iki mikrogram yabani tip veya Snyper Cas9 proteinini iki mikrogram SGRNA ile karıştırın ve RNP kompleksleri yapmak için oda sıcaklığında on dakika kuluçkaya yatırın.
Hücreleri trypnize ve saymak, sonra onları yıkayın ve metin protokolünde belirtildiği gibi elektroporasyon tampon bunları hazırlamak. 30 milisaniye boyunca 1300 volt bir darbe kullanarak hücrelere RNP kompleksleri elektroporate. Elektroporasyondan hemen sonra, hücreleri %10 FBS ve %1 antibiyotiklerle desteklenen 500 mikrolitre DMEM ile dolu 48 kuyuluk bir plakaya yerleştirin.
%5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yat. DMEM'deki HEK293 T hücrelerini %10 FBS ve %1 antibiyotiklerle %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede koruyun. Transfeksiyondan bir gün önce hücreleri deneyin ve sayın.
48-iyi ölçekte çalışıyorsa, plaka 10, kuyu başına 000 hücre ve tam büyüme ortamı 250 mikrolitre. Lipid bazlı transfeksiyon reaktifi kullanarak, transfeksiyon için 250 nanogram P3S Cas9 plazmid ve 250 nanogram SGRNA hazırlayın. Daha sonra plazmidleri 25 mikrolitre serumsuz MEM ile karıştırın.
25 mikrolitre serumsuz MEM ile bir mikrolitre transfeksiyon reaktifini seyreltin. Bu karışımı oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Plazmid karışımını transfeksiyon reaktif karışımı ile birleştirin ve plazmid lipofektamin kompleksleri oluşturmak için 20 dakika boyunca odada kuluçkaya yatırın.
Bundan sonra, her iyi içeren hücrelere doğrudan bu karışımın 50 mikrolitre ekleyin. Yavaşça karıştırmak için ileri geri plaka kaya. Trans-gen ekspresyonu için tahmin etmeden önce hücreleri transfeksiyon sonrası 48 ila 72 saat karbondioksit kuvözde 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Önceden hazırlanmış genomik DNA'yı yalıttma ettikten sonra, PcR tarafından GDNA'nın yükseltilmesi ile hedef te ve hedef dışı hedef alan astarlarla derin sıralama kütüphaneleri oluşturun. Ardından, her örneği etiketlemek için dizin astarlarını kullanın. Havuz kitaplıklarını eşleştirilmiş uç sıralamasına tabi tutturmak için yeni nesil bir sıralama makinesi kullanın.
Snyper ekranı yapıldıktan sonra, sağkalım kolonilerinin yüzdesi seçici LB plakası üzerindeki kolonilerin sayısının seçici olmayan LB plakaüzerindeki koloni sayısına bölünmesiyle hesaplanabilir. SP Cas9 kitaplıkları ile yapıldığında bu yüzde genellikle çok düşük olsa da, gerçek pozitif isabetler kalan havuz ile ekran tekrarlayarak zenginleştirilebilir. Temsili bir Snyper ekranı üçüncü ekrandan sonra %100 sağkalım oranının elde olduğunu gösterir.
RNP veya plazmid kodlanmış Snyper Cas9 kullanılarak transfeksiyonlar çeşitli hedefler için yapılabilir ve bunun sonucunda hedef ve hedef dışı faaliyetler hedef amplicon dizilimi ile ölçülür. Çoğu hedefte, Snyper Cas9 hedef faaliyetlerde aynı düzeyde ve vahşi tipe göre daha yüksek özgüllük oranlarını gösterir. Kesilen SGRNA'lar özgüllüğü daha da artırmak için de kullanılabilir.
İlk temizlik adımında daha yüksek dönüşüm verimliliği, klonları yüksek özgüllükte kaybetmemek için çok önemlidir. Daha sonraki tarama adımları, klonlar ilk tarama adımında zaten zenginleştiğinden ve onları kaybetme şansı daha az olduğundan daha az dönüşüm verimliliğini yineler. Snyper ekranında bulduğumuz birden fazla klon olacak.
Bu klonların hedef ve hedef dışı faaliyetleri en iyi performansa sahip klonları seçmek için mümkün olduğunca çok farklı hedefolarak karakterize edilmelidir. Bu yöntemle, bilim adamları hedef aktivite kaybı olmadan Cas9 benzeri enzimlerin özgüllüğünü artırabilir. Buna ek olarak, bilim adamları iyileştirmeler yapmak için proteinin yapısı hakkında herhangi bir ön bilgiye gerek yoktur.
