自然界では、Cas9は、進化が自発的な突然変異を持つウイルスDNAを切断することができる無差別特異性を持つCas9を好む侵入ウイルスに対する免疫タンパク質です。我々は、高い特異性を有する最適化されたCas9バリアントを好む人工的な指向進化システムを構築した。ネガティブとポジティブの選択は、スナイパースクリーニングシステムで同時に機能します。
ターゲット外アクティビティを削減したCas9バリアントもターゲット上のアクティビティを維持し、一度にスクリーニングすることができます。ミューテーションは、スクリーニングされるライブラリを生成するために、Cas9配列全体にランダムに導入されました。そして、これは予期せぬ位置に突然変異を見つけることを可能にしました。
現在、アカデミアや産業界の多くの研究者が、治療開発のためにY型Cas9を使用しています。しかし、Y型Cas9の特異性は最適化されておらず、密に詰め込まれる可能性があります。ヒトでは、これはランダムな遺伝子の予期せぬ突然変異を意味し、重篤な副作用につながる可能性があります。
治療薬で開発されている酵素のような多くのCas9があります。この技術は、ジピンガー、タイ、Cas9などの他のDNAや核の特異性を向上させるために使用できます。ライブラリを十分な大きさにすることが重要な機能を持つバリアントを取得する可能性を高めるための鍵です。
冷却工程で高効率を得て、高効率の有能なセルを使用してください。この手順を開始するには、CCDBプラスミドとSGRNAプラスミドの両方のナノグラムを2重のミスマッチを持つ1つのナノグラムを解凍されたBW25141 GOI細胞の50マイクロリットルに加えます。ピペットで細胞を穏やかに混ぜ、冷やした0.1センチメートルのエレクトロポレーションキュベットに移します。
エレクトロポレーションを介して2つのプラスミドで大腸菌を変換します。エレクトロポレーションが完了した直後に、SOC培地を250マイクロリットル加えます。溶液を穏やかにピペットして細胞と培地を混合し、混合物を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移した。
形質転換した細胞を回収し、摂氏32度で1時間穏やかな揺れを起分させます。テキストプロトコルで概説されているように、スナイパースクリーニングセルの準備を続けます。スナイパースクリーニングを行う準備ができたら、先に説明したelctroporationプロセスを用いて各ライブラリーから調製されたCas9変異体プラスミドの100ナノグラムでスナイパースクリーニング細胞を変換する。
次いで、250マイクロリットルの細胞を新鮮な1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移す。1ミリリットル当たり10ナノグラムの最終濃度にATCの250ピコグラムを追加します。ATC含有細胞とATCフリーセルの両方を、穏やかな揺れで摂氏32度で1時間インキュベートして回収します。
回収したATCフリー細胞のプレート25マイクロリットルをLB寒天プレート上に、クロラムフェニコールおよびカナマイシンを含有する。245ミリメートルLB寒天プレート上のミリリットルあたり100ナノグラムの最終的な濃度に細胞を含む細胞を含むATCにATCを追加します。すぐにクロラムフェニコール、カナマイシン、およびアラビノースを含むプレートを含むLB寒天にATC含有細胞をプレートします。
すべてのプレートを摂氏32度で一晩インキュベートします。翌日、プレートを撮影します。オープンCFUソフトウェアを使用して、生存可能なコロニーの数を数え、非選択的プレート上のコロニーの数がライブラリの多様性よりも少なくとも10倍大きいことを確認し、すべての変異体をカバーする。
3つのライブラリすべてから選択的プレートで生き残ったコロニーを引っ張ります。これらのプールされたコロニーを250ミリリットルのLB培地に移し、クロラムフェニコールを補充し、摂氏42度で一晩インキュベートする。まず、Cas OFファインダーソフトウェアをロードしてターゲットサイトを選択します。
Cas9の特定のタイプと標的ゲノムに適したPAMタイプを選択します。[クエリシーケンス] タブに入力します。不一致番号を選択し、[送信] ボタンをクリックします。
数秒後に、ターゲットサイトとオフターゲットサイトが表示されます。一般的に、1 ~ 3 個の不一致があるオフターゲット サイトを選択します。次に、テンプレートシーケンスでCRRNAとトラックRRNAオリゴを注文し、テキストプロトコルで概説されているようにテンプレートを増幅します。
2%アガロースゲルで増幅されたテンプレートDNAの2マイクロリットルを分析し、その後、テンプレートを精製します。反応混合物を摂氏37度で一晩インキュベートする。翌日、0.5マイクロリットルのドナーゼを加え、摂氏37度で15~30分間インキュベートし、SGRNAを精製します。
次いで、100単位のRNAを3度摂氏3度で3時間、3度の3時間、体外転写RNAの10マイクログラムを摂氏3度で処理し、処理したSGRNAを精製する。まず、10%FBSと1%の抗生物質を5%の二酸化炭素で摂氏37度で補ったDMEMのHEK293 T細胞を維持する。次に、野生型またはスニパーCas9タンパク質の2マイクログラムとSGRNAの2マイクログラムを混合し、RNP複合体を作るために10分間室温でインキュベートします。
トリプシン化し、細胞を数え、それらを洗浄し、テキストプロトコルで概説されているようにエレクトロポレーションバッファでそれらを準備します。RNP複合体を1300ボルトの1パルスで30ミリ秒で細胞内に電気ポレートします。エレクトロポレーションの直後に、500マイクロリットルのDMEMを充填した48ウェルプレートに細胞をプレートし、10%FBSと1%の抗生物質を補います。
5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートする。10%FBSと1%の抗生物質を5%の二酸化炭素で摂氏37度で補ったDMEMのHEK293 T細胞を維持する。トランスフェクションの前日、トリプシン化し、細胞を数えます。
48ウェルスケールで作業する場合、プレート10,000細胞/ウェルおよび完全な成長培地の250マイクロリットル。脂質ベースのトランスフェクション試薬を使用して、トランスフェクション用にP3S Cas9プラスミド250ナノグラムとSGRNA250ナノグラムを調製します。次いで、無血清MEMの25マイクロリットルにプラスミドを混合する。
25マイクロリットルの無血清MEMでトランスフェクション試薬を1マイクロリットル希釈します。この混合物を室温で5分間インキュベートする。プラスミド混合物をトランスフェクション試薬混合物と組み合わせ、20分間室内でインキュベートし、プラスミドリポフェクタミン複合体を形成します。
この後、細胞を含む各ウェルに直接この混合物の50マイクロリットルを追加します。プレートを前後に軽く揺らし、混ぜます。トランス遺伝子発現をアッスする前に、トランスフェクション後48〜72時間、二酸化炭素インキュベーターで37°Cで細胞をインキュベートします。
以前に調製したゲノムDNAを分離した後、標的およびオフターゲットを標的とするプライマーを用いてGDNAのPCR増幅により深いシーケンシングライブラリを生成する。次に、インデックスプライマーを使用して各サンプルにラベルを付けます。次世代シーケンスマシンを使用して、ペアエンドシーケンスをプールライブラリに適用します。
スナイパースクリーンが行われた後、生存コロニーの割合は、非選択的LBプレート上のコロニー数で選択的LBプレート上のコロニー数で割ることによって計算することができる。この割合は、通常、SP Cas9のライブラリで実行すると非常に低いですが、実際の正のヒットは、残っているプールで画面を繰り返すことで豊かにすることができます。代表のスナイパー画面は、第3画面の後に100%生存率が得られていると示す。
RnPsまたはプラスミドコード化されたスニパーCas9を使用したトランスフェクションは、様々なターゲットに対して行うことができるため、ターゲットアンプリコンシーケンシングによって測定されたオンターゲットおよびオフターゲットの活動が得られる。ほとんどのターゲットでは、Snyper Cas9は、野生のタイプと比較して、ターゲットアクティビティと高い特異度比の同じレベルを示しています。切り捨てられた SGRNA を使用して、特異性をさらに向上させることもできます。
第1の洗浄工程における変換効率の向上は、クローンを高い特異性で失わないことが非常に重要である。後のスクリーニングステップは、クローンが最初のスクリーニングステップで既に濃縮されているため、変換効率が低下し、失われる可能性が低くなります。スナイパー画面で見つけたクローンが複数存在します。
これらのクローンのオンターゲットおよびオフターゲットのアクティビティは、最高のパフォーマンスでクローンを選択するために、できるだけ多くの異なるターゲットで特徴付けられる必要があります。この方法を用い、科学者は標的活性を失うことなくCas9様酵素の特異性を改善することができる。さらに、科学者は改善を行うためにタンパク質の構造に関する事前の知識を必要としません。
