Le RT-PCR imbriqué a été développé pour détecter tous les lyssavirus, y compris les 16 espèces approuvées par l’ICTV et deux nouvelles espèces de Lyssavirus. La validation de cette méthode a été prouvée en utilisant plus de 9000 spécimens de cerveau animal en 10 ans de diagnostic clinique de rage et de surveillance en Chine. Le RT-PCR imbriqué peut non seulement produire des résultats crédibles sur des échantillons de tissus cérébraux frais, mais aussi sur des échantillons dégradés.
L’inondation de cette méthode peut être utilisée pour assayer des spécimens de liquide biologique tels que le liquide céphalo-rachidien, la salive et l’urine, de sorte que cette méthode peut être appliquée dans les diagnostics ultimatum. Afin de minimiser la contamination par le report du PCR, il est important de préparer des contrôles négatifs et positifs Il est vraiment important de prendre des mesures. Par exemple, pour chaque extraction d’ARN a besoin de préparation, PCR mis en place, et l’électrophoresis gel doit être exploité dans des zones physiquement séparées.
Il est également recommandé d’utiliser des bandes spirales dans l’extraction de l’ARN et la transcription inverse afin de prévenir la contamination par la rage à la chaîne peptidique. Une manipulation adéquate, comme la préparation de vos agents sur la glace, le changement régulier de gants et l’utilisation de matériaux exempts de ribonuclease, empêchera l’introduction de la ribonucléase et éliminera la dégradation de l’ARN. Pour commencer cette procédure, extraire l’ARN du tissu suspecté de rage, biopsies de peau, salive, fluide céphalo-rachidien ou culture cellulaire infectée par RABV comme décrit dans le protocole de texte.
Lorsqu’ils sont prêts à aller de l’avant, retirer les réacoleurs nécessaires du congélateur et les garder sur la glace. Assurez-vous de décongeler et vortex chaque reagent avant utilisation. Pour la transcription inversée de l’ARN viral à l’ADNC, préparez 12 micro litres de mélange de réaction pour chaque échantillon sur glace et un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre tel que décrit dans le tableau 1 du protocole de texte dans une salle blanche.
Pour tenir compte des variations de pipetage, préparez un volume de mélange principal d’au moins une taille de réaction supérieure aux besoins, puis divisez le mélange de réaction en tubes PCR de 0,2 millilitre. Dans un poste de travail PCR dans une salle de modèle, ajouter huit microlitres de l’échantillon ou l’un des contrôles au mélange de réaction. Le contrôle positif est l’ARN extrait de la culture cellulaire infectée par la souche CVS11 à RABV fixe, tandis que le contrôle négatif contient de l’eau distillée double sans arnse.
Mélanger le contenu de chaque tube en vortexant d’abord, puis en centrifugant brièvement. Après cela, charger les tubes de réaction dans un thermocycler. Configurer et exécuter le programme de synthèse de l’ADND tel qu’il est décrit dans le protocole texte.
Tout d’abord, récupérez les reagents nécessaires et gardez-les sur la glace dans une salle blanche jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi. Une fois prêts, décongeler et vortex les reagents. Ensuite, préparez 48 microlitres de mélange PCR de premier tour pour chaque échantillon dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre tel que décrit dans le tableau 2 du protocole de texte et divisez le mélange de réaction en tubes PCR de 0,2 millilitre.
Dans un poste de travail PCR dans une salle de modèle, ajouter un échantillon de deux microlitres de l’ADND dans le mélange PCR premier tour. Inclure deux microlitres de CVS11 cDNA comme un contrôle positif, et deux microlitres d’eau distillée double comme un contrôle négatif. Ensuite, transférez les tubes scellés dans un thermocycleur PCR et cycle en utilisant les paramètres énumérés dans le tableau 3 du protocole de texte.
Pour commencer, préparez 48 microlitres de mélange PCR de deuxième tour pour chaque échantillon dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre tel que décrit dans le tableau 4 du protocole de texte et divisez le mélange de réaction en tubes PCR de 0,2 millilitre. Ajoutez deux microlitres du produit PCR de premier tour dans le mélange PCR de deuxième tour. Inclure l’eau distillée double comme un contrôle négatif pour ce tour de PCR.
Effectuez ensuite le thermocyclisme PCR à l’aide des paramètres énumérés dans le tableau 3 du protocole texte. Tout d’abord, ajouter 1,5 grammes d’agarose à 100 millilitres de Tris-acétate EDTA et le chauffer dans un four à micro-ondes pour le dissoudre complètement. Ensuite, ajouter le bromure d’éthidium à une concentration finale de 0,01%Verser le gel dans le moule et le laisser solidifier à température ambiante pendant au moins 30 minutes.
Préparer les échantillons de chargement en mélangeant cinq microlitres de chaque produit PCR avec un microlitre de tampon de chargement 6x. Chargez séparément les échantillons et le marqueur d’ADN approprié dans les puits et exécutez le gel pendant environ 30 à 45 minutes à 120 volts jusqu’à ce que la ligne de colorant soit approximativement 75 à 80% vers le bas du gel. Lorsque la course est terminée, éteignez l’alimentation et déconnectez les électrodes de la source d’énergie.
Ensuite, retirez soigneusement le gel de la boîte de gel. Utilisez un dispositif de documentation de gel UV pour visualiser et photographier les fragments d’ADN. Caractérisez le PCR à transcription inversée imbriqué tel qu’il est décrit dans le protocole de texte.
Les résultats d’un représentant imbriqué RT-PCR pour détecter 18 espèces de Lyssavirus est montré ici. Les contrôles positifs PCR montrent la bande attendue à 845 paires de base dans l’amplification du premier tour et à 371 paires de base pour le second. Aucune bande n’est vue pour les contrôles négatifs.
Les 18 lyssavirus produisent les deux mêmes bandes que le contrôle positif, ce qui indique que le RT-PCR imbriqué a détecté les 18 Lyssavirus. Alors que 16 des plasmides ont une amplification efficace en deux tours de PCR, deux d’entre eux, le virus Aravan et le virus Ikoma, ne sont amplifiés que dans le premier ou le deuxième tour, respectivement. La sensibilité de la méthode varie dans la détection de différents plasmides lyssavirus, des valeurs allant de 2,24 à 2, 240 molécules par microlitre.
Ces différences peuvent être attribuées aux inadéquations entre les amorces et les modèles en raison de la diversité des séquences virales. Une comparaison de 9 624 tissus cérébraux provenant de spécimens cliniques testés par PCR imbriqué par rapport à ceux testés avec fat montre que rt-PCR imbriqué comme une sensibilité de 100% et une spécificité de 99,97%La conformité entre les deux méthodes est de 99,07%Dix autres laboratoires de rage ont été invités à effectuer le test pour valider davantage le RT-PCR imbriqué. Les dix laboratoires ont obtenu des résultats rt-PCR imbriqués qui sont 100% conformes à la FAT, sans faux négatifs ou faux positifs, ce qui indique que le RT-PCR imbriqué a une grande spécificité et reproductibilité.
Rt-PCR est maintenant recommandé par l’OIE pour l’utilisation des technologies de la rage. Et notre RT-PCR imbriqué a été prouvé comme la norme nationale des technologies de rage en Chine en 2018.
