Le protocole décrit ici permet de générer des banques d’ARN pleine longueur mutagènes aléatoirement de génomes viraux à ARN simple brin positif jusqu’à 10 kilo-octets de longueur, et de sélectionner les phénotypes d’intérêt dans les conditions expérimentales souhaitées. Cette technique permet de créer des banques d’ARN viraux pleine longueur avec différents niveaux de diversité génétique en peu de temps en utilisant une approche sans clonage. La technique utilise des réactifs peu coûteux et largement disponibles pour la synthèse de bibliothèques.
Shaheen Khan, doctorante de la section de virologie du département des sciences de la vie de l’Université Shiv Nadar, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, effectuez l’ep-PCR en préparant le mélange maître pour quatre séries d’expériences avec des amorces directes et inverses ainsi que les composants de la réaction sans le modèle pJFH1, comme décrit dans le manuscrit du texte. Aliquote le master mix en quatre tubes.
Ajoutez 100 nanogrammes, 50 nanogrammes, 25 nanogrammes et 10 nanogrammes du modèle dans les tubes individuels et ajustez le volume total de la réaction à 50 microlitres. Appliquez les conditions de cyclage pour amplifier un fragment de paire de base 97 36. Estimez le produit ep-PCR amplifié en chargeant cinq microlitres de produits PCR et en le comparant aux quantités connues d’une échelle d’ADN kilobase en exécutant une électrophorèse sur gel d’agarose à base de 0,8 % de TAE.
Purifier le produit à l’aide d’un kit de purification en colonne. Estimer la concentration du produit purifié en mesurant l’absorbance à 260 nanomètres. Concentrez le produit ep-PCR sous vide pour obtenir une concentration de produit égale ou supérieure à 100 nanogrammes par microlitre.
Mettez en place une réaction de synthèse d’ARN in vitro et placez-la à 37 degrés Celsius pour l’incubation. Purifiez ensuite le produit synthétisé à l’aide d’un kit de purification en colonne. Mettre en place une réaction de synthèse d’ADNc de 20 microlitres en ajoutant environ un microgramme d’ARN viral, cinq amorces inverses micromolaires et 200 unités de transcriptase inverse, selon les recommandations du fabricant.
À l’aide de l’ADNc, préparez un mélange réactionnel tel que décrit dans le manuscrit du texte et exécutez un cycle d’amplification. Exécutez le produit sur un gel d’agarose à base de 0,8 % de TAE pour confirmer la taille du produit de 25 paires de 71 bases, puis purifiez le produit à l’aide d’un kit de purification en colonne comme démontré précédemment. Elute dans 40 microlitres d’eau stérile.
Pour ajouter un porte-à-faux A à trois primes, ajoutez 0,5 micromolaire de DATP et une unité d’ADN polymérase Taq basse fidélité, et incubez l’ensemble du produit PCR à 70 degrés Celsius pendant 30 minutes, avec 1X tampon PCR et 1,5 millimolaire de chlorure de magnésium. Purifiez ensuite le mélange à l’aide d’un kit de purification en colonne. Mettez en place la réaction de ligature et incubez-la à température ambiante pendant trois heures.
Ajoutez ensuite 100 microlitres d’Escherichia coli DH5-Alpha à l’ADN ligaturé et choquez les cellules à 42 degrés Celsius pendant 35 secondes. Ajouter un millilitre de milieu LB à la suspension cellulaire et incuber en agitant doucement pendant une heure à 37 degrés Celsius. Centrifugeuse à 13, 800 RCF.
Jeter le surnageant et le remettre en suspension dans 200 microlitres de milieu LB frais. Plaquer 100 microlitres de cellules E. coli DH5-Alpha transformées sur une plaque LB contenant 50 microgrammes par millilitre d’ampicilline, et incuber à 37 degrés Celsius pendant 16 heures. Mettez en place des mini-préparations de 25 à 30 colonies dans cinq millilitres de milieu LB contenant 50 microgrammes par millilitre d’ampicilline, et cultivez pendant la nuit à 37 degrés Celsius.
Le lendemain, extraire les plasmides à l’aide d’un kit commercial et effectuer une digestion enzymatique de restriction dans un volume de 10 microlitres avec 200 nanogrammes des plasmides isolés, deux unités d’EcoR1 et un tampon de restriction 1X pour toutes les colonies. Après avoir incubé les mélanges de digestion à 37 degrés Celsius pendant trois heures, chargez les produits sur un gel d’agarose à base de 0,8 % de TAE pour confirmer l’insertion de l’ADN plasmidique. Effectuer le séquençage de Sanger des plasmides de 25 clones positifs à l’aide des amorces recommandées.
Un jour avant la transfection, divisez les cellules et comptez le nombre de cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, ensemencez l’hépatome humain de 7,5 cellules dans des boîtes de 35 millimètres dans deux millilitres de DMEM complet, et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 16 heures dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, préparez le complexe lipidique de transcription en diluant 10 microlitres de réactif de transfection dans 50 microlitres du milieu essentiel minimal, et diluez séparément cinq microgrammes de transcrits viraux dans 50 microlitres du milieu essentiel minimal.
Incuber les deux mélanges à température ambiante pendant 10 minutes. Mélangez-les ensuite dans un seul tube de microcentrifugation stérile et incubez le mélange à température ambiante pendant 30 minutes. Après l’incubation des cellules, retirez le milieu de culture, lavez les cellules deux fois avec du PBS 1X préchauffé et ajoutez 1,5 millilitre du milieu essentiel minimal.
Ajoutez lentement le complexe et remuez doucement le plat pour une distribution uniforme. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 10 heures. Retirez ensuite le support.
Lavez les cellules transfectées deux fois avec un millilitre de PBS 1X préchauffé et ajoutez deux millilitres de DMEM complet. Isolez l’ARN viral de 140 microlitres de surnageants de culture à l’aide d’une trousse d’isolement d’ARN viral. Mettez en place une réaction qRT-PCR de 10 microlitres à l’aide d’un kit qRT-PCR commercial.
Utilisez les amorces directes et inverses et la sonde pour la quantification de l’ARN du VHC. Réglez le cycle de réaction sur 48 degrés Celsius pendant 20 minutes, 95 degrés Celsius pendant 10 minutes, 45 cycles à 95 degrés Celsius pendant 15 secondes et 60 degrés Celsius pendant une minute. Exécutez les réactions et configurez des contrôles négatifs.
En parallèle, générer une courbe standard à l’aide d’un nombre de copies connu dix fois dilué en série des transcrits du VHC pour quantifier l’ARN viral. Effectuer en trois exemplaires. Plaquer des cellules d’hépatome humain de 7,5 dans une plaque de 96 puits et incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone environ 16 heures avant d’ajouter le virus.
Dans une armoire de biosécurité de classe II, effectuer des dilutions en série décuplées du virus. Ajoutez 100 microlitres du virus dilué par puits pour infecter les cellules, et incubez-les à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Après trois jours, lavez les cellules infectées trois fois avec 0,1 millilitre de PBS, et fixez et perméabilisez les cellules avec 0,1 millilitre de méthanol glacé à moins 20 degrés Celsius pendant 20 minutes.
Lavez les puits avec 1X PBS trois fois, puis 1X avec PBST. Après avoir retiré le PBST, bloquez les cellules pendant 30 minutes à température ambiante avec 0,1 millilitre de 1 % de BSA contenant 0,2 % de lait écrémé dans le PBST. Retirez la solution bloquante et traitez les cellules pendant cinq minutes avec 0,1 millilitre de peroxyde d’hydrogène à 3 % préparé dans 1X PBS.
Encore une fois, lavez les cellules deux fois avec 1X PBS et 1X avec PBST. Ajouter 50 microlitres d’anticorps monoclonal anti-NS5A 9E10 par puits, et incuber à température ambiante pendant une heure. Lavez les puits trois fois avec 1X PBS et une fois avec PBST.
Ajouter 50 microlitres d’IgG secondaires conjuguées de chèvre et de souris HRP par puits, incuber pendant 30 minutes à température ambiante, puis retirer l’anticorps non lié en lavant les puits avec 0,1 millilitre de PBS 1X. Ajoutez 30 microlitres de DAB et incubez l’assiette en la balançant doucement pendant 10 minutes à température ambiante. Retirez la solution DAB et lavez les puits deux fois avec 1X PBS et une fois avec de l’eau distillée.
Ajouter 100 microlitres de PBS contenant 0,03 % d’azoture de sodium. Examinez chaque puits au microscope à lumière inversée à l’aide d’un objectif 10X. Comptez le nombre de puits positifs.
Utilisez un calculateur de Reed et Muench pour estimer la dilution finale qui infecte 50 % des puits. Dissoudre le pibrentasvir, un inhibiteur de la NS5A, dans du DMSO à 100 % jusqu’à une concentration d’un millimolaire et le diluer davantage dans du DMEM complet jusqu’à une concentration de 10 nanomolaires. Ensuite, infectez des cellules Huh-7,5 naïves à 70 % de confluence avec une dose de virus ML50 pour infecter 50 % des cellules pendant 12 heures, puis transférez les cellules infectées sur des plaques à six puits 24 heures après l’infection.
Ajouter 1X CE50 PIB aux cellules infectées après 16 heures de fractionnement cellulaire. Faites-le après chaque division cellulaire pendant six passages consécutifs, suivis de trois cycles de passage sans médicament, et surveillez la propagation du virus à l’aide d’un test de mise au point. Récoltez les surnageants viraux à chaque passage et conservez-les à moins 80 degrés Celsius.
Extraire l’ARN viral du surnageant au jour 18 et l’ADNc synthétisé. Amplifier le gène NS5A à l’aide de cinq microlitres d’ADNc dilué. Déterminez ensuite les mutations de résistance aux médicaments NS5A dans six à huit plasmides bactériens positifs à l’aide des amorces de séquençage NS5A.
Des banques de mutants du génome complet ont été synthétisées à l’aide de pJFH1 clonal en quantités décroissantes de 100 à 10 nanogrammes. Les rendements moyens des produits ep-PCR variaient de 3,8 à 12,5 nanogrammes par microlitre. La proportion de mutations dans les banques mutantes augmentait avec la diminution de l’apport de pJFH1 dans la réaction ep-PCR.
Le ML50 synthétisé à l’aide de 50 nanogrammes du modèle comportait quatre substitutions par 10 000 paires de bases copiées, tandis que le ML25 synthétisé à l’aide de 25 nanogrammes de modèle comportait neuf substitutions. Aucune substitution dans le nombre de nucléotides séquencés n’a été trouvée dans la pJFH1 clonale. Les variants viraux ML50 étaient moins sensibles au pibrentasvir que le virus clonal JFH1.
Sur les huit clones de NS5A, quatre avaient une combinaison de D7V + F28C, tandis que V8A + F28C et F36L se produisaient dans un clone chacun. Ces mutations se trouvaient dans la région N terminale de NS5A, qui est connue pour abriter des mutations de résistance NS5A cliniquement pertinentes. La concentration finale de chaque composant de l’ep-PCR est essentielle, en particulier la quantité de matrice.
L’absence de KB Extender réduira considérablement le rendement du produit ep-PCR.
