La sonde largement utilisée CFDA, ou apr. JFC, ou apr. JADA, est non fluorescente. Les deux groupes H3 et la position de 3'6'sur ce composé le rendent perméant à la membrane. Lorsqu’une fois à l’intérieur des cellules, les acétates cellulaires internes élimineront les groupes d’acétate et libéreront la nouvelle forme de CFDA.
C’est une carboxyfluorescéine, ou les FC, qui est fluorescente. Et parce que cette nouvelle forme est moins membrane-perméante, le poids, toutes les cellules est de se déplacer à travers les pores intercellulaires, ou le plasmodesmata dans les plantes, qui fait de ce diacétate la sonde idéale pour étudier le transport intercellulaire dans l’activité phloème. Dans la vidéo d’aujourd’hui, nous allons démontrer la charge de CFD dans la racine et l’hypocotyl des usines d’Arabidopsis, respectivement, et nous montrerons comment les deux procédures légèrement différentes affecteront le mouvement de bas en haut de cette sonde fluorescente.
Obtenir des résultats de coloration de façon cohérente, nous stockons les graines d’Arabidopsis récoltées dans quatre degrés Celsius, 40% armoire d’humidité. Les graines nouvellement récoltées stockées dans cet état pendant plus de sept jours sont facilement utilisées pour le semis. Pour nous assurer que chaque plante est cultivée dans un espace relativement similaire dans la boîte de Petri, nous utilisons une carte de qualité zone de semences.
Maintenant, mouiller la pointe stérilisée, tremper dans les graines stérilisées, et semer les graines un par un sur la position désignée. Après avoir fini de semer, sceller la boîte de Petri avec du parafilm et un ruban adhésif, les mettre sur un support de boîte de Pétri pour le laisser pousser verticalement. Voici les outils que nous allons utiliser dans cette expérience.
S’il vous plaît noter que nous serions mieux de charger le colorant aussi rapidement que nous le pouvons. Normalement, vous terminez l’ensemble du processus en 10 à 15 minutes. Avant d’effectuer l’expérience de chargement CFDA, nous préparons toujours une nouvelle solution CFDA.
Ici, diluer le CFDA d’un millimlaire en cinq concentrations de micromolaires avec de l’eau avant d’être immédiatement utilisé. Couper le parafilm en petits morceaux de trois par trois millimètres. Parce qu’il y a de la condensation sur le couvercle et le fond de la boîte de Pétri, nous devons les dégager avec du papier absorbant pour éviter que le colorant ne circule.
Une petite pièce de parafilm est mise sous la racine. Soulevez les plantes et mettez-les sur le couvercle. Couper les racines d’environ cinq à 10 millimètres sous l’hypocotyle.
Reprendre les pousses sur les petits morceaux de parafilm. Maintenant, appliquez soigneusement un microlitre CFDA sur l’extrémité de coupe de la racine. Essayez d’éviter de contaminer toutes les proto-plantes.
Couvrez ensuite le couvercle, puis laissez-les dans la salle de croissance pendant deux heures. La méthode hypocotyl-pinçant. La petite pièce de parafilm, comme précédemment préparé, est mise sous la jonction racine-hypocotyl.
Nous utilisons un forecep pour pincer doucement l’hypocotyl près du tissu racinaire, et appliquer soigneusement 0,1 microlitre CFDA sur le côté pincé et laisser la plante pendant deux heures. Les photos de neuf à 12 jours après la zone de coloration des plantes. Ils montrent tous le modèle vasculaire de coloration dans les cotyléons et les vraies feuilles.
Seulement dans un cas très rare, la feuille de cotyledon a montré un modèle de coloration de demi-feuille. Donc, fondamentalement, les deux méthodes n’ont pas fait de différence dans le modèle de coloration des FC, mais si nous effectuons le chargement des colorants dans de plus en plus d’usines, nous constatons que les deux procédures donnent une différence significative dans l’efficacité. Avec la méthode de coupe des racines, environ 70% des plantes montrent le signal fluorescent dans la pousse.
Mais l’efficacité peut être augmentée à 91% en utilisant la méthode hypocotyl-pincement. Nous avons également essayé la méthode de pincement des racines, mais cette méthode se traduire par l’efficacité encore plus faible, c’est environ 30%Par conséquent, il semble que la façon de charger le colorant ne tient pas compte de la différence de coloration. La différence réside très probablement dans les sites de chargement, qui pourraient être séparés par une barrière symplastique.
Nous avons montré comment nous chargeons le CFDA dans les racines arabidopsis et l’hypocotyl. Nous avons utilisé deux procédures légèrement différentes, et ces deux procédures légèrement différentes entraînent une différence significative dans ce mouvement de sonde de bas en haut. Nous suggérons que cette méthode pourrait nous aider à identifier une barrière symplastique potentielle pour les signaux de tir dérivés des racines.
