La culture de callosités végétales fournit une solution pour l’évaluation précise, efficace et rapide de la dégradation métabolique des xénobiotiques chez les plantes. La culture de callosités végétales peut exclure les interférences du microbiome ou des champignons et la dégradation photochimique, simplifier l’effet de matrice des plantes intactes, normaliser les conditions de culture, raccourcir la durée du traitement et nécessiter moins d’efforts expérimentaux. La méthode proposée ici pourrait fournir un aperçu du comportement d’absorption et des mécanismes métaboliques de différents polluants organiques sur les cultures et être utile pour les efforts d’évaluation des risques environnementaux.
Pour commencer, autoclavez tout le matériel et effectuez toutes les opérations dans un établi ultra propre stérilisé aux UV. Stérilisez la surface de la graine vernalisée avec de l’éthanol à 75 % pendant 20 minutes. Rincez-les trois fois avec de l’eau déminéralisée stérile et stérilisez-les à nouveau avec du peroxyde d’hydrogène à 20 % pendant 20 minutes.
Après avoir lavé les graines six fois avec de l’eau déminéralisée stérilisée, faites-les germer de manière aseptique en les semant sur un milieu Murashige et Skoog autoclavé et sans hormones d’un pH de 5,8 contenant 1% de gel d’agar et incubez à 26 degrés Celsius avec une période de photo de 16 heures pendant 15 jours. Après 15 jours d’incubation des graines, coupez l’hypocotyle et le cotylédon de la plantule en petits morceaux de 0,5 centimètre pour obtenir les explants. Transformez les explants dans une boîte de Pétri contenant 15 à 20 millilitres de milieu Murashige et Skoog autoclavé complété par de l’Oxymon et de la phycocyanine et incubez dans l’obscurité à 26 degrés Celsius pendant trois à quatre semaines pour induire le durillon.
À l’aide d’un scalpel stérile et d’une pince, séparez le cal d’environ un centimètre de diamètre formé à partir des explants initiaux. Pour le traitement, dissoudre le 2,4-dibromophénol dans 10 millilitres de milieu liquide aseptique Murashige et Skoog. Ajoutez ensuite trois grammes de callosités de carottes séparées à la solution de 2,4-dibromophénol préparée.
Après avoir préparé le médium à blanc comme décrit dans le manuscrit, incubez tous les flacons dans l’obscurité. Pour préparer l’échantillon, séparez soigneusement le cal du traitement au 2,3-dibromophénol et contrôlez les flacons par filtration avec des filtres en fibre de verre de 0,45 micron. Lavez le cal trois fois avec de l’eau ultra-pure avant de le recueillir.
Lyophiliser tous les callosités collectées et homogénéiser 0,2 gramme de callosités séchées avec un broyeur de tissus à haut débit à 70 hertz pendant trois minutes. À l’aide d’une microseringue en verre, ajouter 50 microlitres de 4-n-nanophénol deutéré de substitution dans le cal et le vortex homogénéisés pendant une minute. Ajoutez cinq millilitres de la solution contenant un rapport égal de méthanol et d’eau au cal dopé et sonicez-le pendant 30 minutes pour extraire le 2,4-dibromophénol et les métabolites.
Après l’extraction, centrifuger la suspension à 8 000 G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes et recueillir le surnageant par pipetage. Passez l’extrait à travers une extraction en phase solide équilibrée lipophile hydrophile ou une cartouche HLB-SPE avec un débit d’un millilitre par minute. Diluez les analytes en faisant passer six millilitres de méthanol à travers la cartouche HLB-SPE.
Concentrez ensuite l’éluant obtenu à un millilitre sous un léger jet d’azote gazeux pour l’analyse instrumentale. Pour l’analyse, ouvrez la porte de la colonne chauffante. Installez ensuite la colonne de chromatographie liquide ultra performante en connectant l’entrée de la colonne à la vanne d’injection et la sortie à l’entrée du spectromètre de masse.
Insérez l’extrémité des tubes de solvant A et B dans les flacons de solvant correspondants. Placez les flacons d’échantillons par numéro de série aux emplacements correspondants des plateaux d’échantillons et réinsérez les plateaux d’échantillons dans la chambre d’échantillonnage. Dans la fenêtre du logiciel, cliquez sur Instrument, puis sur Méthode d’entrée pour modifier les conditions du chromatogramme en phase liquide.
Sélectionnez MS Method (Méthode MS) et configurez les paramètres de l’analyse du spectre de masse. Cliquez sur Fichier, puis sur Nouveau pour créer et nommer la base de données. Chargez l’exemple de programme créé ci-dessus en sélectionnant Fichier MS, puis Fichier d’entrée et Injecter le volume.
Enregistrez la base de données dans l’exemple de dossier du projet en cliquant sur Fichier et Enregistrer. Ensuite, sélectionnez Exécuter et démarrer dans la fenêtre principale du logiciel et cliquez sur Acquérir des exemples de données, puis sur le bouton OK dans la liste d’exemples de démarrage pour collecter des données. Pour traiter les données, sélectionnez la ligne de données cible et cliquez sur la fenêtre du chromatogramme pour afficher le chromatogramme MS scan.
Dans la fenêtre du chromatogramme, cliquez sur Affichage, puis sur TIC. Après avoir cliqué sur l’onde de balayage DS, ajoutez trace et OK pour obtenir le balayage des spectres de masse filles. Le chromatogramme de l’extrait de callosité de carotte traité au 2,4-dibromophénol a montré la présence de huit métabolites différents par rapport aux échantillons témoins.
De plus, l’absence de pic de 2, 4-dibromophénol parent dans le chromatogramme indique le métabolisme rapide du 2,4-dibromophénol dans le cal de la carotte dans des conditions expérimentales. De plus, le 2,4-dibromophénol incubé dans le cal de la carotte a conduit à la formation de métabolites par conjugaison directe avec du glucose et des acides aminés. Tout l’équipement ainsi que le milieu Murashige et Skoog doivent être autoclavés pour s’assurer que la différenciation et l’entretien des callosités de la plante sont effectués dans des conditions aseptiques.
Les approches omiques suivant cette procédure permettent de créer une image mécanistique phytotoxique claire des polluants environnementaux.
