Ce protocole peut être utilisé pour effectuer la livraison convection améliorée chez les petits rongeurs à l’aide d’un système de cathéter étape pour la perfusion uniforme réglable des régions cérébrales cibles. L’avantage de la livraison convection-améliorée est qu’elle permet la livraison des substances dans la région d’intérêt contournant la barrière de sang-cerveau avec peu de dommages de tissu ou reflux. Cette technique est principalement utile pour la livraison de substances thérapeutiques telles que les anticorps dans le cerveau.
Et peut donc être utilisé pour cibler de nombreuses affections neurologiques. Michal Beffinger, post-doc de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez par couper un morceau de tubes capillaires en silice fondue d’un diamètre intérieur de 0,1 millimètre et d’une épaisseur de mur de 0,325 millimètre à une longueur de 30 millimètres.
Après avoir examiné le tube pour les fissures utiliser une microforge pour polir les extrémités pour s’assurer que les ouvertures de tubes ont une surface lisse. Ensuite, montez une aiguille de calibre 27 sur une seringue de 10 micro litres et placez la seringue dans un robot stéréotaxique. Utilisez le robot pour déplacer la seringue sur une surface dure et toucher la surface avec la pointe de l’aiguille.
Après avoir noté cette position élever l’aiguille pour permettre le placement de la silice fondue capillaires à l’intérieur de l’aiguille de sorte que 20 millimètres du capillaire dépasse de l’aiguille. Utilisez une pipette pour répartir uniformément deux microlitres d’adhésif cyanoacrylate à haute viscosité sur le capillaire à partir de l’aiguille métallique et en terminant dix millimètres au-dessus de l’extrémité inférieure du capillaire. Utilisez le robot stéréotaxique pour abaisser l’aiguille métallique jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille soit d’un millimètre au-dessus de la surface de référence pour fixer le capillaire de silice fondu dans l’aiguille métallique formant une étape d’un millimètre de la pointe de l’aiguille métallique.
Retirer tout excès de colle qui se forme à l’extrémité de l’aiguille métallique pour éviter de planter l’étape du cathéter. Vérifiez la pointe au microscope pour confirmer que tout l’excès de colle a été enlevé. Ensuite, attendez 15 minutes pour que la colle durcisse et retirez la seringue avec le cathéter du robot.
Pour l’essai de cathéter d’étape, couper solidifié le gel d’agarose de 0,6 % en blocs de 20 par 20 millimètres et remplir manuellement la seringue de cathéter d’étape avec 10 microlitres de solution bleue filtrée de 0,4 % trypan. À l’aide du robot stéréotaxique, distribuez un microlitre de colorant à 0,2 micro litres par minute pour évaluer l’étanchéité de l’étape du cathéter pendant la procédure de fixation. La solution bleu trypan doit être visible uniquement sur le bout du cathéter.
Essuyez le colorant avec un tissu de papier et placez un bloc d’agarose dans le robot stéréotaxique. Calibrate le robot a dit que la pointe du cathéter est référencée contre la surface du bloc agarose. Définissez une séquence de proportion des volumes d’injection selon le plan expérimental spécifique.
Pour injecter la solution dans le putamen caudate murine, réglez l’injection à un millimètre frontal et un millimètre et demi à deux millimètres latéraux de la position de brème à une profondeur de 3,5 millimètres. Lorsque l’aiguille est en position, démarrez la procédure de livraison améliorée par convection et injectez cinq microlitres de solution bleue trypan dans le bloc agarose. Évaluer la forme du nuage bleu trypan dans l’agarose et les fuites potentielles le long du tractus cathéter.
Aucun retour majeur sur la pointe de l’aiguille métallique ne doit être visible. Après l’injection, laisser le cathéter en place pendant deux minutes avant de retirer l’aiguille à un millimètre par minute afin d’assurer une bonne dispersion du liquide dans le cerveau et l’étanchéité du tractus d’injection pendant l’ablation. Placez un nouveau bloc d’agarose dans le robot et commencez une deuxième injection d’un microlitre à 0,2 micro litres par minute pour évaluer l’obstruation du cathéter dans l’agarose.
Le bleu trypan doit à nouveau former un nuage à partir de la pointe du cathéter immédiatement après le début de l’injection. Ensuite, évaluez si les restes de volume dans la seringue correspondent à 3 microlitres car toute variation pourrait indiquer une fuite de liquide à travers le montage du cathéter ou le piston de seringue. Pour l’injection d’anticorps dans le striatum murine confirmer un manque de réponse à pincement de la peau dans une souris anesthésiée et raser la tête avec un coupe-cheveux.
Désinfecter la peau avec des cotons-tiges trempés dans la solution d’iode. Utilisez un scalpel pour faire une incision cutanée de 10 millimètres le long de la finition crânienne de la ligne médiane au niveau des yeux. Fixez la souris dans le cadre stéréotaxique à l’aide de la pince nasale et des barres d’oreille, en prenant soin que la surface du crâne est horizontale et bien fixée.
Placez la seringue dans le robot stéréotaxique et synchronisez le foret avec la pointe du cathéter sur un point de référence. Utilisez des forceps pour rétracter la peau et localiser le bregma à la surface du crâne. Bregma de référence dans le logiciel en utilisant la pointe du foret et déplacer la perceuse à un millimètre frontal et deux millimètres latéraux de la position bregma.
Percer un trou de bavures en prenant soin de ne pas endommager la dura mater et déplacer la seringue sur le trou de bavure. Distribuez 0,5 à un microlitre de la seringue pour s’assurer qu’aucune bulle d’air n’est laissée dans le cathéter. Commencez la convection a augmenté la livraison comme démontré, en observant la surface du crâne pour toute trace de flux de liquide à partir de la tache d’injection.
À la fin de l’administration et l’enlèvement du cathéter commencent la pompe d’injection à 0,2 micro litres par minute pour vérifier s’il y a des signes d’obstruation du cathéter pendant l’injection. S’il n’y a pas eu obstruation, une gouttelette de mélange d’injection doit être immédiatement observée provenant de la pointe du cathéter. Dans cette image d’un nuage de formation de bleu trypan après l’injection d’un microlitre de colorant à 0,5 micro litres par minute à l’aide d’un cathéter amélioré de convection comme démontré, aucun reflux le long du tractus d’aiguille n’était visible au début de l’étape de cathéter.
Et le nuage dispersé formait une forme sphérique désirée. Dans cette image utilisant une aiguille d’extrémité émoussée cependant, le reflux significatif pourrait être observé. Notamment, la convection a amélioré la livraison permet la perfusion de grands volumes dans le cerveau murin d’une manière uniforme et moins dommageable tissulaire par rapport à l’injection conventionnelle.
Dans les deux types de livraison, il existe un profil de distribution typique des particules d’anticorps et de dextran sur le corpus callosum. Cependant, le profil de dispersion de l’anticorps injecté est plus diffus que ce qui est observé pour le dextran de poids moléculaire élevé après la convection a amélioré la livraison, ilplifiant des différences dans la distribution entre différents infusates. Comme le cathéter peut potentiellement obstruer pendant l’infusion du cerveau, il est important de le vérifier immédiatement après en distribuant lentement un petit volume d’infusate.
Cette procédure peut servir de moyen d’offrir des composés pharmacologiquement actifs au cerveau et devrait être suivie d’une surveillance étroite des symptômes de la maladie et des effets secondaires attendus. Cette technique permet l’infusion d’une région cérébrale précise avec des thérapeutiques, y compris des anticorps, ouvrant de nouvelles possibilités pour le développement de thérapies ciblées du système nerveux central.
