Nous tenons à remercier Curt Mazer d&#39;Isis Pharmaceuticals pour fournir des conseils relatifs à la chirurgie bolus ICV, ainsi que Isis Pharmaceuticals dans son ensemble pour fournir notre laboratoire avec ASOS. En outre, nous tenons à remercier Carey Shaner de révision de cet article. TMM et SLD sont pris en charge par des subventions du NIH P50AG005681, K08NS074194 et R01NS078398.

Le protocole ci-dessous a été approuvé par l&#39;Institutional Animal Care et comités utilisation à l&#39;Université Washington à St Louis et est en conformité avec les Instituts de lignes directrices de Santé pour l&#39;utilisation des animaux de laboratoire national. Si c&#39;est votre première fois, des opérations chirurgicales, nous vous conseillons d&#39;examiner l&#39;article JoVE sur les chirurgies de rongeurs en guise d&#39;introduction avant de commencer 14. OSS peuvent être livrés à la CNS de souris à la fois par perfusion de la pompe osmotique et une injection en bolus unique ICV. Pour cette raison, la procédure décrite ci-dessous est divisée en deux segments. Avantages et inconvénients de chaque méthode seront abordés dans la section Discussion. Les coordonnées utilisées dans les protocoles sont pour adultes C57BL6 et B6C3 souris. Coordonnées correspondantes de rat peuvent être trouvés dans le tableau 1. Pompe osmotique ALZET 1. Préparation des pompes osmotiques Alzet <ol><li> Fixer un drap stérilee et déposez soigneusement les éléments suivants sur elle tout en prenant soin de ne pas toucher directement quelque chose pour maintenir la stérilité: pompe osmotique (s), le débit modulateur (s), 1 ml seringue stérile (s), lame de scalpel, et des sections de tubes (1 morceau de tube = 5 pompes). Pour les souris, il ya trois options pour les pompes: 14 jours, 28 jours et 42 jours (figure 2A). </li><li> Déboucher et remplir tubes coniques de 50 ml stériles avec une solution saline ml 15-20. Jusqu&#39;à 6 pompes assemblées peuvent être ajoutés par tube conique. </li><li> Remplir un plat p60 Petri avec de l&#39;éthanol à 100%. Ajoutez nombre approprié de cathéters à l&#39;éthanol. Pour les souris, la longueur du cathéter est de 2,5 mm. </li><li> Filtrer chaque ASO en autant de tubes Eppendorf de 1,5 ml, si nécessaire. Inclure un tube Eppendorf stérile rempli de solution saline 0,9% pour remplir le tube avec. </li><li> Une fois que tout est prêt, mettre des gants stériles. Assurez-vous de ne pas toucher tout ce qui n&#39;est pas stérile. Changer de gants si nécessaire. </li><li> Pour chaque ASO à être utilisé, remplir une seringue de 1 mlet loadpumps en plaçant l&#39;aiguille dans le trou supérieur et en remplissant lentement jusqu&#39;à l&#39;excès s&#39;échappe. Continuez jusqu&#39;à ce que toutes les pompes sont remplis. </li><li> Déboucher le Flow-modulateurs et l&#39;insérer dans les pompes. Poussez le flux modulateur quasi-totalité de la manière, en laissant un espace de 3-5 mm. </li><li> Utilisation de la lame de scalpel, couper chaque morceau de tube en 5 segments égaux. Prenez un morceau de tube, remplir avec du sérum physiologique stérile en utilisant une seringue de 1 ml, et insérez le haut du modulateur de débit dans une extrémité de la tubulure. Ensuite, prendre une canule à partir de l&#39;éthanol et de le connecter à l&#39;autre extrémité de la tubulure. La pompe est maintenant entièrement assemblé. </li><li> Placez la pompe complètement montée dans le tube conique stérile de 50 ml avec une solution saline pour l&#39;amorçage. L&#39;amorçage permet aux pompes pour s&#39;imprégner de liquide pour amorcer la livraison de la drogue ainsi que venir à la bonne température. temps d&#39;amorçage: 14 pompes à jour: 4-6 h, 28 pompes à jour: 40 h, 42 pompes à jour: 60 h. Lorsque vous avez terminé le montage des pompes, plafonner les tubes coniques et les placer dans un endroit propre37 ° C bain d&#39;eau jusqu&#39;à ce que la chirurgie. </li></ol> 2. Procédure de pré-chirurgicale <ol><li> Tout essuyer avec 70% d&#39;éthanol pour stériliser la région et établir des draps stériles sur le dessus de table et stereotax pour créer un champ stérile. Il est important de tenir compte du champ stérile pendant toute la chirurgie. Allumez le suivant: stérilisateur à billes, plaquettes de chauffage, lumière, affichage numérique et de l&#39;oxygène / System isoflurane (Figure 1). </li><li> Les éléments suivants seront nécessaires si cela soit une simple intervention chirurgicale ou tout un lot de chirurgies comme nous le faisons régulièrement: 1 paire de pinces, 1 pince hémostatique courbe, 1 paire de petits ciseaux, 1 paire de petits ciseaux émoussés courbes, 1 rat coupe d&#39;os , 1 pince hémostatique droite, 5-0 fils de nylon, 1 tubes coniques avec 70% d&#39;éthanol, 1 tube conique avec de l&#39;éthanol à 95%, 1 tube conique avec de l&#39;iode, 1 tube conique avec du peroxyde d&#39;hydrogène, paquet de cotons-tiges stériles, 1 bouteille de super colle, 1 tube de pommade antibiotique, 1 tube de l&#39;œilun lubrifiant, et une rasoir électrique. </li><li> Placez les pointes des deux paires de ciseaux, pinces, et hémostatique courbe dans le stérilisateur à billes pendant 15 secondes. Retirer et placer dans l&#39;éthanol à 70%. Lorsque vous effectuez plus d&#39;une intervention chirurgicale, re-stériliser les pointes des instruments entre les animaux. </li><li> Tourner la isoflurane à 4% et de O 2 à 0,4 l / min et le débit de gaz directement vers la chambre. Nous avons notre système oxygène / isoflurane étalonné au moins une fois par an pour s&#39;assurer que nous fournissons la quantité appropriée de l&#39;anesthésie. Placez la souris dans la chambre et d&#39;attendre jusqu&#39;à ce que la respiration est considérablement ralenti. Retirez la souris et effectuer un pincement de l&#39;orteil pour assurer la souris est complètement inconscient. </li><li> Raser les poils de la partie supérieure de l&#39;épaule jusqu&#39;à entre les yeux. Si la souris commence à se réveiller, placez la souris de nouveau dans la chambre jusqu&#39;à ce que la souris est complètement inconscient de nouveau, confirmant avec un pincement de l&#39;orteil. Placez la souris anesthésiée sur le stereotax et pousser le cône de nez sur le nez.Soyez doux comme les dents et les os sont fragiles. </li><li> Diriger le flux de gaz vers le stereotax pour maintenir la souris anesthésiées. Il est important de vérifier de temps en temps pour s&#39;assurer que la souris est complètement inconscient avec un pincement de l&#39;orteil tout au long de l&#39;opération. Fixer la tête avec les barres d&#39;oreilles. Nous préférons nivellement barres d&#39;oreilles, mais de cibler le ventricule latéral, un crâne parfaitement de niveau n&#39;est pas nécessaire en raison de la grande taille du ventricule. </li><li> Tournez le niveau isoflurane en baisse à 2,0% pour l&#39;entretien. Dab pommade sur chaque œil. Comme on le voit dans la vidéo, mettre un champ stérile sur la souris de sorte que seule la base du cou et la tête sont exposés. Puis désinfectez la zone chirurgicale en essuyant le sommet de la tête et du cou dans un mouvement circulaire en partant du centre de la zone rasée et vers l&#39;extérieur premières avec un coton-tige trempé dans de l&#39;éthanol à 95%, suivie par un coton-tige trempé dans de l&#39;iode en mouvement. </li><li> Nous vous recommandons d&#39;utiliser un système de sonde rectale de retour à température contrôlée de chauffage qui assurela température de la souris reste à un niveau stable 37 ° C. Si la température de la souris diminue au cours de la chirurgie, le rétablissement post-opératoire peut prendre plus de temps et l&#39;hypothermie résulte peut conduire à l&#39;activité de la protéine aberrante, y compris hyperphosphorylation de la protéine Tau associée aux microtubules 15. Après la mise en place du système de chauffage, vous êtes maintenant prêt à commencer l&#39;opération. </li></ol> 3. Implantation de pompe osmotique Alzet <ol><li> Avant de commencer l&#39;opération, mettre sur une nouvelle paire de gants stériles. Ensuite, l&#39;aide de pinces et d&#39;une petite paire de ciseaux, faire une incision dans la peau de la base du cou au-dessus du crâne de l&#39;animal à un maximum entre les yeux </li><li> Prenez les ciseaux émoussés avec la courbe vers le haut et glisser sous la peau à la base du dos du cou vers le membre postérieur gauche. Il devrait y avoir aucune résistance. Si c&#39;est le cas, enlever les ciseaux et essayez à nouveau. Cela constitue la poche sous-cutanée de la pompe osmotique. </li><li> Wipe le crâne propre avec des cotons-tiges stériles, suivie d&#39;un coton-tige trempé dans du peroxyde d&#39;hydrogène pour améliorer bregma. </li><li> Essuyer les 50 ml tubes coniques qui contiennent des pompes pour maintenir la stérilité de la pompe. Prendre soin d&#39;une pompe du tube conique en utilisant la pince hémostatique courbe, en prenant soin supplémentaire que la pompe ne touche pas les parois du tube conique. Maintenir la base de la pompe avec une pince et enfoncez le modulateur de débit dans le reste de la voie avec la pince hémostatique courbe. </li><li> Maintenez la pompe où le modulateur et tubes flux rencontrer la pince hémostatique courbe. Introduire la pompe sous la peau à la base du cou et de le repousser vers le membre postérieur gauche aussi loin qu&#39;il peut aller sans résistance. Soyez prudent de ne pas laisser toucher quoi que ce soit du cathéter. </li><li> Avec la pince hémostatique courbe, prenez la canule à la gorge, où le sommet se réunit le piédestal. Déplacez le conducteur canule en place et fixez en place. </li><li> Placez une seule goutte de super glue sur la base de la canule. Push en haut de la canule dans le pilote et la position de sorte que le tube est pointé vers l&#39;arrière. </li><li> Touchez l&#39;extrémité du cathéter à bregma et zéro les coordonnées sur l&#39;écran numérique. Soulever et déplacer le cathéter de 1,1 mm latéralement vers la droite et de 0,5 mm en arrière (figure 2B). Maintenez la peau de la route avec la pince hémostatique courbe. </li><li> Pousser la sonde métallique mince à travers le crâne jusqu&#39;à ce que le fond de la canule en matière plastique est bien pressé contre le sommet du crâne. Le cathéter de métal peut être conduit directement à travers le crâne chez la souris en raison du crâne mince relative. Si vous utilisez des rats, percer un trou dans le crâne avant d&#39;abaisser le cathéter. </li><li> Retirez toute la peau qui a de la colle sur l&#39;éloigner du crâne. Avec le pilote canule tenant la canule / cathéter en place, attendre 1-2 minutes pour que la colle sécher complètement. </li><li> Lors de la pratique, afin d&#39;évaluer la pose du cathéter, injecter ul 20-40 de 2,5% Dye FastGreen travers le tube (figure 2C). Attendez 2-3 min, perfuse la souris avec du PBS 1X 0,03% héparine, et enlever le cerveau. Couper coronaire au niveau du site de cathéter. Si le cathéter a été placé dans le ventricule, le colorant sera perfusée dans le système ventriculaire de la souris (figure 2D). </li><li> Maintenir le cathéter en place avec la pince hémostatique courbe tout en augmentant le conducteur. Relâchez doucement la pince hémostatique pour s&#39;assurer que la canule est correctement fixé sur le crâne. </li><li> Avec un coton-tige, appuyez sur le haut de la canule. Monter les tondeuses osseuse de rat dans le bosquet entre le sommet et la base de la canule. Coupez le haut de la canule tout en appuyant avec le coton-tige. Essayez de garder le niveau de coupe afin de ne pas détacher la canule du crâne. Si la canule ne se décolle, rapidement re-colle et appliquer une pression avec un coton-tige pour 2 min de plus. </li><li> Utilisation du fil de suture 5-0, hémostatique régulière, et forceps, suture le long de l&#39;ouverture complète, en accordant une attention particulière à droite sur la canule. Nous utilisons un Running horizontal suture matelas (voir figure 5) en raison de la plus grande incision sur le crâne. </li><li> Appliquer une noisette de pommade antibiotique sur la tête et le cou. Dévissez les bars de l&#39;oreille et desserrer le cône de nez. Débranchez la souris de l&#39;stereotax et les placer sur un coussin chauffant pour la récupération. Surveiller étroitement les souris pendant toute la durée de la récupération, allant généralement de 10-30 minutes. Consultez toutes les 2-3 minutes jusqu&#39;à ce que la souris commence à marcher autour et se toiletter. </li></ol> 4. Soins post-opératoires <ol><li> Surveiller les souris quotidiens après la chirurgie pour la première semaine. </li><li> Si une souris semble être dans la douleur ou de détresse, nous recommandons de prévoir la souris avec un mg / kg par injection sous-cutanée de 5 Carprofen une fois tous les 24 heures pour 5 jours afin de soulager la douleur. </li><li> Si il semble y avoir une infection, appliquez généreusement une pommade antibiotique à la zone jour et consulter un vétérinaire traitant pour s&#39;assurer que la plaie se cicatrise correctement. </li><li> REDéplacez le fil de nylon 5-0 7-10 jours après la chirurgie pour éviter l&#39;irritation de fil de suture. </li></ol> 5. Modification ou suppression pompe osmotique Alzet Après la pompe se fait infuser activement ASO, il peut être modifié ou complètement enlevé. <ol><li> Suivez la même procédure pré-opératoire que ci-dessus avec les modifications suivantes: 1) vous n&#39;aurez pas besoin de ciseaux courbes, hémostatique courbe, coupe osseuse de rat, ni l&#39;affichage numérique, et 2) à la place d&#39;apprêter la tête de la souris, le rasage ou l&#39; désinfecter le dos de la souris, à la jonction de la pompe et la tubulure. </li><li> Faire une incision cm 1.5 à l&#39;arrière de la souris, perpendiculaire à la jonction pompe / tuyau, l&#39;aide de pinces et de ciseaux. Retirez soigneusement la pompe hors de l&#39;incision sans tirer de façon significative / poussant sur le tube que cela puisse ébranler le cathéter. </li><li> Pour retirer la pompe, couper le tuyau d&#39;environ 0,5 cm au-dessus du modulateur de débit et de toucher la colle au tube to joint la fermer. Attendez 1-2 min pour que la colle sèche. Remettre le tube dans l&#39;incision et suture fermée. Dab onguent antibiotique sur la peau suturée et le lieu de la souris sur un tapis de récupération chauffée. </li><li> Pour changer la pompe, sont fraîchement préparés pompes prête aussi d&#39;un plat de 10 cm remplie par de l&#39;éthanol à 95%. Les cathéters sont pas nécessaires avec les nouvelles pompes. </li><li> Prenez une nouvelle pompe avec la pince. Trempez vos doigts dans de l&#39;éthanol, s&#39;emparer de la pompe, et jeter le flux modulateur. Puis, lentement et avec précaution retirer l&#39;ancienne pompe à partir du modulateur de débit fixé à la tubulure et de la canule. Dès qu&#39;il est éteint, faites glisser lentement la nouvelle pompe, veiller à ce que le modulateur de débit ne touche jamais à l&#39;extérieur de la souris. </li><li> Remettez la nouvelle pompe à travers l&#39;incision de nouveau dans le paquet sous-cutanée et suture la peau. Dab onguent antibiotique sur la plaie et le lieu souris sur le bloc de récupération. </li><li> Tout comme avec l&#39;implantation de la pompe, contrôler les souris tous les jours après l&#39;opération pour vérifier pain / inconfort et infections. Traiter avec Carprofen et des antibiotiques lorsque cela est jugé nécessaire. </li></ol> ICV BOLUS 6. Procédure de pré-chirurgicale <ol><li> Suivez la même procédure de pré-chirurgie de l&#39;article 2 ci-dessus avec les modifications suivantes: 1) vous n&#39;aurez pas besoin de ciseaux courbes, hémostatique courbe ou des couteaux en os de rat; 2) Nettoyez à 10 ul seringue Hamilton et l&#39;aiguille avec de l&#39;eau stérilisée et charge avec ASO et 3) fixer la seringue et l&#39;aiguille de l&#39;appareil de stéréotaxie où se trouvait le conducteur canule. </li></ol> Sept. Injection d&#39;un bolus d&#39;ASO <ol><li> En utilisant des pinces et une petite paire de ciseaux, faire une incision de la base du cou jusqu&#39;à entre les yeux. </li><li> Essuyez le crâne propre avec des cotons-tiges stériles, suivie d&#39;un coton-tige trempé dans du peroxyde d&#39;hydrogène pour améliorer bregma. </li><li> Déplacez la seringue / aiguille en place et le fixer. Assurez-vous que la partie biseautée de l&#39;aiguille face postérieure. Baissezl&#39;aiguille jusqu&#39;à ce qu&#39;elle touche bregma. Zéro toutes les coordonnées. Déplacer l&#39;aiguille latéralement vers la droite 1,0 mm et 0,3 mm antérieur (figure 3A). </li><li> Conduisez lentement l&#39;aiguille dans le crâne jusqu&#39;à ce que le trou de l&#39;aiguille est aligné sur le haut du crâne. Encore une fois, cela peut être fait en raison de la minceur du crâne de la souris. Zéro la coordonnée z et abaisser l&#39;aiguille à -3,0 mm à une vitesse de 1 mm / s (figure 3B). Attendez 2-3 min pour le cerveau pour sceller autour de l&#39;aiguille. </li><li> Livrer le plein 10 pi de ASO à un taux de 1 pl par seconde. Attendez 2-3 min. Nous utilisons un ul débit de perfusion 1 pour OLS dans le ventricule, mais ce taux peut varier entre différents médicaments. Lors de la pratique, vérifier le bon positionnement de l&#39;aiguille en livrant 10-20 ul de 2,5% Dye FastGreen. Perfuser la souris avec du PBS 1X 0,03% héparine peu après perfusion de colorant et de faire des coupes coronales du cerveau afin de vérifier que le colorant se trouve dans le système ventriculaire (figure 3C). </li> &lt;li&gt; Maintenir un coton-tige sur le crâne à la base de l&#39;aiguille. Relever l&#39;aiguille à une vitesse de 1 mm par seconde. Dès que l&#39;aiguille est en dehors de la boîte crânienne, rouler le coton-tige sur le trou de l&#39;aiguille et maintenir pendant 1 minute afin d&#39;éviter toute fuite de ASO. </li><li> Suturer la peau fermé, appliquer un onguent antibiotique, et le lieu souris sur le bloc de récupération chauffée. Selon concentration ASO, il peut prendre 20 min pour quelques heures pour se remettre complètement. </li><li> Tout comme avec l&#39;implantation de la pompe, contrôler les souris tous les jours après l&#39;opération pour vérifier la douleur / gêne et les infections. Traiter avec Carprofen et des antibiotiques lorsque cela est jugé nécessaire. </li></ol>

<ol>
	<li>Crooke, S. T., Bennett, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+antisense+oligonucleotide+therapeutics.">Progress in antisense oligonucleotide therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 107-129 (1996).</li><li>Sazani, P., Kole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+antisense+oligonucleotides+as+modulators+of+alternative+splicing.">Therapeutic potential of antisense oligonucleotides as modulators of alternative splicing.</a> The Journal of Clinical Investigation. 112 (4), 481-486 (2003).</li><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+Proteins+in+Neurodegenerative+Disease.">Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease.</a> Science. 296 (5575), 1991-1995 (2002).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).</li><li>Miller, T. M., Smith, R. A., Kordasiewicz, H., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-Targeted+Therapies+for+the+Central+Nervous+System.">Gene-Targeted Therapies for the Central Nervous System.</a> Archives of Neurology. 65 (4), 447-451 (2008).</li><li>Vickers, T. A., Koo, S., Bennett, C. F., Crooke, S. T., Dean, N. M., Baker, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Reduction+of+Target+RNAs+by+Small+Interfering+RNA+and+RNase+H-dependent+Antisense+Agents.">Efficient Reduction of Target RNAs by Small Interfering RNA and RNase H-dependent Antisense Agents.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278, 7108-7118 (1074).</li><li>Smith, R. A., Miller, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+Oligonucleotide+therapy+for+neurodegenerative+disease.">Antisense Oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 116 (8), 2290-2296 (2006).</li><li>Rosen, D. R., Siddique, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Cu/Zn+superoxide+disumutase+gene+are+associated+with+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Mutations in Cu/Zn superoxide disumutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature. 362, 6415-62 (1993).</li><li>Haidet-Phillips, A. M., Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+from+familial+and+sporadic+ALS+patients+are+toxic+to+motor+neurons.">Astrocytes from familial and sporadic ALS patients are toxic to motor neurons.</a> Nature Biotechnology. 29, 824-828 (2011).</li><li>Furukawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+roles+of+wild-type+Cu,Zn-superoxide+dismutase+in+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Pathological roles of wild-type Cu,Zn-superoxide dismutase in Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Neurology Research International. 2012, 1-6 (2012).</li><li>Hua, Y., Sahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model.">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes and Development. 24, 1634-1644 (2010).</li><li>Passini, M. A., Bu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+Oligonucleotide+Delivered+to+the+Mouse+CNS+Ameliorate+Symptoms+of+Severe+Spinal+Muscular+Atrophy.">Antisense Oligonucleotide Delivered to the Mouse CNS Ameliorate Symptoms of Severe Spinal Muscular Atrophy.</a> Science Translational Medicine. 3 (72), (2011).</li><li>Kordasiewicz, H. B., Stanek, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+Therapeutic+Reversal+of+Huntington's+Disease+by+Transient+Repression+of+Huntingtin+Synthesis.">Sustained Therapeutic Reversal of Huntington's Disease by Transient Repression of Huntingtin Synthesis.</a> Neuron. 74 (6), 1031-1044 (2012).</li><li>Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Rodent+Surgery+for+the+New+Surgeon.">Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon.</a> J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).</li><li>Planel, E., Richter, K. E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+Leads+to+Tau+Hyperphosphorylation+through+Inhibition+of+Phosphatase+Activity+by+Hypothermia.">Anesthesia Leads to Tau Hyperphosphorylation through Inhibition of Phosphatase Activity by Hypothermia.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (12), 3090-3097 (2007).</li><li>Southwell, A. L., Skotte, N. H., Bennett, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+oligonucleotide+therapeutics+for+inherited+neurodegenerative+diseases.">Antisense oligonucleotide therapeutics for inherited neurodegenerative diseases.</a> Trends in Molecular Medicine. , (2012).</li><li>Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+therapeutics:+beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides.">RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11, 125-140 (2012).</li></ol>

Les auteurs reçoivent leurs oligonucléotides antisens d&#39;Isis Pharmaceuticals.

La capacité à délivrer des médicaments au niveau mondial dans le SNC, comme indiqué dans la vidéo est une technique extrêmement puissante qui est facile à la fois apprendre et à utiliser. Avec la pratique, une seule implantation de la pompe ou un ICV bolus peut être complété en 10 min, ce qui permet de grandes cohortes de souris d&#39;être traités en même temps. Ceci est particulièrement utile pour les études avec un affichage de comportement, comme un plus grand nombre de comportement de la souris sont essentiels pour aider à voir des différences significatives. Basé sur nos expériences livrant OLS via des pompes et des injections en bolus, nous avons observé quelques avantages et inconvénients de chaque méthode. Il convient de noter que ce sont les opinions dans notre laboratoire et peuvent ne pas être vrai pour tous les modèles de souris et de rat. Nous trouvons un avantage de l&#39;utilisation des pompes est leur capacité à fournir une grande quantité d&#39;ASO depuis l&#39;ASO est répartie sur une période beaucoup plus longue. Cela équivaut généralement à knockdown plus soutenue ou après épissage actifASO perfusion, si ce n&#39;est pas toujours le cas. Les pompes permettent aussi d&#39;un calendrier précis de livraison ASO (14 jours, 28 jours, ou 42 jours) et les pompes peuvent être changés une fois pour permettre une perfusion ASO encore plus actif. Cependant, nous avons remarqué que le changement de pompes plus d&#39;une fois augmente la variabilité due à la formation de poches fibreux autour de la pompe qui empêchent la pompe de bien absorber le fluide. Un inconvénient des pompes est que certaines souris ne tolèrent pas la pompe ainsi que d&#39;autres. Si la lignée transgénique vous travaillez avec est plus fragile, une pompe peut être trop lourd. Les pompes doivent également être supprimés après la dernière perfusion, en soumettant des souris à une autre chirurgie et l&#39;anesthésie ajoutée. Si faire le travail de comportement, il est particulièrement important d&#39;enlever la pompe et permettre au moins 1-2 semaines de récupération, car la présence de la pompe aura une incidence sur certains comportements chez les souris. Avec ICV bolus injections, un avantage est le coût. Il s&#39;agit d&#39;uneinvestissement initial pour acheter les seringues et les aiguilles, mais au fil du temps, les injections en bolus sont plus rentables car il n&#39;y a pas de pompes / tubes / cathéters à acheter. Dans l&#39;ensemble, il ya moins de place-garde avec les injections en bolus ICV en raison du manque de canules et des pompes. Nous constatons également que bolus ICV peuvent être utilisés pour délivrer OLS à des souris jeunes fragiles et / ou plus. Un inconvénient de l&#39;ICV bolus, c&#39;est que c&#39;est une seule injection. Pas autant globale ASO peut être livré par cette voie, et si la durée d&#39;action de l&#39;ASO utilisé est courte, les effets de knockdown / d&#39;épissage sera également de courte durée. Les deux pompes osmotiques ainsi que les bolus ICV ont la capacité de fournir des OLS qui peuvent protéines knockdown ou d&#39;en altérer l&#39;épissage des gènes dans tout le système nerveux central des rongeurs, une technique qui a de larges applications dans de multiples domaines liés aux neurosciences. Nous vous suggérons pilotons les deux méthodes de livraison si vous n&#39;êtes pas sûr de la voie d&#39;administration est le mieux adapté pour votre sétude pécifique.

Certains médicaments ne peuvent pas traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE), nécessitant Système Nerveux Central directe (CNS) de livraison. Pour contourner le Bureau, les médicaments peuvent être livrés directement dans le cerveau en utilisant les méthodes décrites. Alors que notre laboratoire et le papier focus détaillé ici sur oligonucléotides antisens (OAS), d&#39;autres médicaments, tels que les petites molécules, des anticorps, des vecteurs de thérapie génique, etc., Peuvent également être fournis par la même approche exacte. Certaines protéines jouent un rôle clé dans la pathogenèse des maladies neurodégénératives. Ces protéines forment souvent des espèces toxiques et s&#39;accumulent pour former des agrégats, conduisant à la mort neuronale et une éventuelle maladie neurologique ultérieure 3-4. Dans un effort pour ralentir ou même stopper la progression de ces maladies, une option thérapeutique peut être de cibler directement et diminuer la protéine en cause. Cependant, ces protéines se trouvent souvent omniprésente à travers le système nerveux central, ce qui rend difficile pour e<html> cibler ffectively eux à l&#39;échelle mondiale. Afin de cibler les gènes tout au long du CNS, nous administrons OLS en souris liquide céphalo-rachidien (LCR) via le ventricule latéral pour contourner le Bureau. Cette méthode spécifique profite du système ventriculaire de la souris qui baigne l&#39;ensemble du cerveau et la moelle épinière, ce qui permet une large diffusion des OLS. Nous utilisons les OLS qui sont 18-20 mer molécules d&#39;ARN-like qui se lient directement la séquence d&#39;ARNm cible et, en fonction des modifications chimiques ASO, soit a) recruter RNase-H à dégrader l&#39;ARNm conduit à knockdown ou B) déplacer l&#39;épissage alternatif 1 , 2,16,17. Il convient de noter que plusieurs molécules existent pour abattre une protéine spécifique in vivo, y compris shRNA. Étant donné que ces molécules ne sont pas l&#39;objet de cet article, nous dirigeons le lecteur à consulter des articles que mieux détailler les mécanismes de knockdown de l&#39;action et les avantages / inconvénients de chacune 5-6. jove_content &quot;&gt; Dans des travaux antérieurs, nous avons utilisé les OLS pour cibler le superoxyde de la protéine superoxyde 1 (SOD1) dans un modèle de rat transgénique de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) 7 (figure 4). mutations SOD1 se produire chez environ 2% de l&#39;ensemble des SLA 8 cas, si elle a été récemment émis l&#39;hypothèse que la SOD1 peut jouer un rôle important dans la SLA sporadique et 9-10. En diminuant total des SOD1 niveaux dans le transgénique rat SLA, la survie après le début a été augmenté de façon significative 7. Ces données importantes ont été les premiers de montrer qu&#39;un traitement ASO dans le SNC pourrait avoir un impact positif considérable sur un modèle de maladie neurologique. Depuis lors, OLS ciblées pour SOD1 humains sont entrés et terminé avec succès un essai de phase I clinique humaine avec des effets secondaires minimes (Clnicaltrails.gov NCT01041222) , tel que présenté à l&#39;horizon 2012 64 e Annual Academy of Neurology américain. plans pour déplacer les OLS impatience essais de phase II sont actuellement en cours. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; tout en ciblant SOD1 était la première démonstration de l&#39;utilisation OLS pour traiter une maladie neurologique, plusieurs autres études ont depuis été réalisées en regardant les différentes maladies et leurs cibles protéiques respectifs. En 2010 et 2011, OLS que l&#39;épissage de décalage de la survie de la protéine de neurone moteur 2 (SMN2) ont été utilisés dans les modèles de souris transgéniques de l&#39;atrophie musculaire spinale (SMA) et ont abouti à une amélioration significative dans les phénotypes de la maladie 11,12. Ces OLS d&#39;épissage sont actuellement en phase I des essais cliniques chez les enfants atteints SMA (Clinicaltrails.gov NCT01494701). En outre, il a été récemment montré que l&#39;administration transitoire des OLS ciblées contre le gène huntingtine ont pu sauver de façon spectaculaire le modèle de la souris de Huntington, même après que les niveaux de protéine huntingtine retour à la normale 13. Dans toutes ces études, les OLS ont été livrés au ventricule latéral pour réduire les niveaux de gènes totales ou modifier l&#39;épissage de gènes parla totalité du système nerveux central. Les deux pompes osmotiques et une seule injection d&#39;un bolus peuvent être utilisés pour délivrer OLS à la CSF. Pompes permettent une lente, livraison continue, alors que le intracérébroventriculaire (ICV) est un bolus, injection rapide une fois. Nous avons utilisé ces deux méthodes avec succès, même si nous n&#39;avons pas rapporté la comparaison directe entre la pompe et le bolus en une seule lignée transgénique. En utilisant OLS dans le SNC est un puissant moyen de diminuer les niveaux de protéines totales et / ou changement épissage de plusieurs protéines. Bien que nous utilisions OLS exclusivement pour le traitement de troubles neurologiques, nous reconnaissons que d&#39;autres domaines peuvent également bénéficier de cette technique. Tant que la protéine d&#39;intérêt est exprimé dans le système nerveux central et le but ultime est de parvenir à des changements CNS à l&#39;échelle de l&#39;expression génique, en utilisant Asos dans les techniques démontrées peuvent être très utiles.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 14 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 1002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 28 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 2004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 42 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 2006</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.5 mm Catheters</td>
 <td>PlasticsOne</td>
 <td>3280PM/SPC</td>
 <td>Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vinyl Catheter Tubing</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>7760</td>
 <td>ID: 0.027", OD: 0.045"</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP</td>
 <td>Baxter</td>
 <td>2F7124</td>
 <td>NOT to be used in pumps or tubing</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.9% Sodium Chloride, Injection, USP</td>
 <td>Hospira</td>
 <td>NDC 0409-4888-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>p60 Petri Dish (Sterilized)</td>
 <td>TRP</td>
 <td>93060</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Surgical Blades (Sterile)</td>
 <td>Butler Schein</td>
 <td>#007319</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Latex Surgical Gloves (Sterile)</td>
 <td>Micro-Touch</td>
 <td></td>
 <td>CatNo will depend on size of the gloves needed</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile Towel Drape</td>
 <td>Dynarex</td>
 <td>4410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>.2um Syringe Filters</td>
 <td>PALL</td>
 <td>4192</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml Syringe (Sterile)</td>
 <td>BD</td>
 <td>309625</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Conical Tubes</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% Ethanol</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>PUMP &amp; BOLUS SURGERY PROTOCOLS </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Forceps</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11001-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Hemostat</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>13009-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine Sharp Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14060-09</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Blunt Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14029-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bone Cutter</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>16104-14</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Straight Hemostat</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>12002-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7653-01</td>
 <td>10 &mu;l gas-tight with removable needles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needles</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7758-04</td>
 <td>26 gauge, Point Style: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5-0 Nylon Suture Thread</td>
 <td>Covidient</td>
 <td>SN-871</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alcohol Pads</td>
 <td>Select</td>
 <td>#521</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cotton Swabs (sterile)</td>
 <td>Puritan</td>
 <td>REF 806-WC</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super Glue</td>
 <td>Loctite</td>
 <td></td>
 <td>Longneck Bottles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CAUTION: FastGreen Dye</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F7252-5G</td>
 <td>Wear Eyeshields and Gloves when handling this product</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic Cream</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eye Ointment</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Electric Shaver</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70% Ethanol</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% Provadone Iodine</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3% Hydogen Peroxide</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Warming Pad</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead Sterilizer</td>
 <td>SouthPointe Surgical</td>
 <td>GRM5-1450</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small Animal Stereotaxic</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 940</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nose Cone</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 923-B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ear Bars</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 921</td>
 <td>This model is optional</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cannula Driver</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 1966</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe Holder</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 1972</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Temperature Control System</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model TCAT-2LV</td>
 <td>Optional</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oxygen/Isoflurane System</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system

En raison de l&#39;impossibilité de traverser la barrière hémato-encéphalique, certains médicaments doivent être livrés directement dans le système nerveux central (SNC). Notre laboratoire se concentre spécifiquement sur des oligonucléotides antisens (OAS), bien que les techniques présentées dans la vidéo ici peuvent également être utilisés pour fournir une pléthore d&#39;autres médicaments pour le système nerveux central. Les oligonucléotides antisens (OAS) ont la capacité de cibles spécifiques d&#39;une séquence knockdown 1 ainsi que des ratios de gènes spécifiques 2 isoformes de quart. Pour atteindre inactivation génique généralisée ou épissage dans le SNC de la souris, les OSS peuvent être livrés dans le cerveau en utilisant deux voies distinctes de l&#39;administration, à la fois dont nous faisons preuve dans la vidéo. Les premières utilisations de pompes osmotiques ALZET, relié à un cathéter qui est implantée chirurgicalement dans le ventricule latéral. Cela permet aux OLS à infuser en continu dans le système nerveux central pour une période de temps déterminée. Le second implique une injection en bolus unique d&#39;un salutgh concentration de ASO dans le ventricule latéral droit. Les deux méthodes utilisent le système ventriculaire cérébral de la souris pour livrer l&#39;ASO à l&#39;ensemble du cerveau et la moelle épinière, mais en fonction des besoins de l&#39;étude, une méthode peut être préféré à l&#39;autre.

Après la perfusion de la pompe ou un temps désigné après l&#39;injection ICV bolus (nous utilisons couramment quatre semaines), il est important de tester l&#39;efficacité des OLS. Nous recommandons de prendre différentes régions du cerveau et la moelle épinière pour mesurer les niveaux / isoformes du gène cible, tant au niveau de l&#39;ARNm par PCR quantitative en temps réel ainsi que le niveau de protéines en utilisant soit le Western Blot ou ELISA (Figure 4 pour un exemple publié ). Cela aidera à déterminer ASO efficacité dans les différentes régions du système nerveux central. Si la demi-vie de la protéine ciblée est longue, nous vous conseillons attendre plus longtemps après ASO perfusion afin d&#39;évaluer knockdown protéines maximum ou épissage. Il est également important de tester la distribution oligo. infusions de pompes résultent de la distribution à travers les deux hémisphères ipsilatéraux et controlatéral, mais une concentration plus élevée ASO est souvent vu dans des zones plus proches du système ventriculaire 16. ICV bolus injections donner un plus équipemrm répartition des oligo travers le CNS 16, même si les effets peuvent ne pas durer aussi longtemps. Nous demandons au lecteur de Southwell et al. Pour voir une comparaison directe de la pompe par rapport à la distribution bolus oligo 16. Nous vous recommandons également de tester des doses multiples ainsi que la durée d&#39;action des OLS puisque chaque ASO se comporte un peu différemment in vivo. OLS ont généralement une assez longue durée d&#39;action, avec knockdown cible ou l&#39;épissage de plusieurs mois après la livraison ASO. En outre, certains OSS fonctionnent mieux que d&#39;autres et certains gènes cibles seront plus faciles à effet de choc que d&#39;autres. Pour cette raison, lorsque le dépistage Asos pour déterminer le candidat de plomb, nous recommandons de tester au moins 3-5 ASO in vivo avec un n = 4-6 souris adultes par ASO en tant que premier passage. Si vous utilisez un autre médicament que OLS, il sera également important pour piloter la concentration idéale du médicament, la durée de la drogue de l&#39;action, et SNC droguela distribution de ce composé spécifique. <img alt="Tableau 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326table1.jpg" /> Tableau 1. Chirurgie des coordonnées. Coordonnées utilisées pour frapper le ventricule latéral droit chez les souris et les rats lors de l&#39;implantation des pompes osmotiques ainsi que l&#39;exécution d&#39;une intracérébroventriculaire (ICV) bolus. Les deux coordonnées, des pompes et des bolus ICV, cibler le ventricule latéral droit. Nous utilisons deux ensembles différents parce que c&#39;est ce dont nous avons le plus d&#39;expérience et de savoir à fournir une excellente répartition de ASO. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig1.jpg" /> Figure 1. Configuration stéréotaxique. (A) L&#39;équipement stéréotaxique nécessaire pour la pompe Alzet et les chirurgies d&#39;injection en bolus. I) Glass Bead Stériliserr. ii) lecture numérique. iii) de base stéréotaxique avec des bras mobiles. iv) Température de plaquettes de chauffage contrôlé. v) L&#39;isoflurane / système d&#39;oxygène. vi) Chambre isoflurane. (B) Gros plan sur le cône de nez et barres d&#39;oreilles. (C) Deux fixations nécessaires. Gauche: Seringue / porte-aiguille pour injections en bolus ICV. Droite: Driver canule pour l&#39;implantation de la pompe osmotique. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig2.jpg" /> Figure 2. Alzet Implantation de pompe osmotique. (A) Alzet options de pompe osmotique pour les souris. . 14 pompes par jour (0,25 pi / h), 28 pompes par jour (0,25 pi / h), 42 pompes par jour (0,15 pi / h) (b) les coordonnées pour l&#39;implantation de la pompe du bregma: -0.5 mm postérieur, -1.1 mm latéral ( droite), et -2,5 mm ventrale (longueur de cathéter). (C) Après avoir conduit le cathéter à travers lecrâne et le collage de la canule, le colorant est balayé à travers le cathéter pour évaluer un placement correct de la sonde dans le ventricule latéral. (D) cerveau perfusé immédiatement après teinture administré comme dans (C). Si cathéter est placé correctement dans le ventricule, le colorant sera distribuée dans tout le système ventriculaire de la souris. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig3.jpg" /> Figure 3. Bolus intracérébro. (A) les coordonnées pour injection bolus de bregma: +0,3 mm antérieure, -1.0 mm latéral (à droite), et -3,0 mm ventrale (B) Après avoir conduit l&#39;aiguille dans le crâne -3.0 mm ventral, colorant est poussé à travers la seringue. à évaluer un placement correct de l&#39;aiguille à la fin du ventricule. (C) cerveau perfusé peu après teinture administré comme dans (B). Si l&#39;aiguille est placée avec succès dans le ventricule, l&#39;colorant sera distribuée dans tout le système ventriculaire de la souris. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4.jpg" /> Figure 4. oligonucléotides antisens réduire SOD1 chez le rat in vivo (figure prises directement à partir de Smith et al. 7). (AD) antisens SOD1 oligonucléotides SOD r146192 ou SOD brouillés ont été perfusés pendant 28 jours dans le ventricule latéral droit de rats normaux à 100 ug / jour. (A) endogènes SOD1 les niveaux d&#39;ARNm de cerveau et la moelle épinière, telle que mesurée par qRT-PCR. ( B) SOD1 et A-tubuline taux de protéines suite ASO perfusion. (C et D) Les teneurs en protéines pour la tubuline et SOD1 quantifiés pour les différentes régions du cerveau après la perfusion. (E) OLS contre la préséniline 1 ou GSK-3 et beta, Ont été perfusé pendant 2 semaines dans le ventricule latéral droit de souris non transgéniques et les niveaux d&#39;ARNm évaluées dans le cortex frontal droit / temporel. Reproduit avec la permission de l&#39;American Society for Clinical Investigation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50326/50326fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5.jpg" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5highres.jpg"/> Figure 5. Suture de roulement horizontale matelas. 5-0 nylon fil de suture est tissé dans et hors de la peau, à partir antérieure et postérieure de travail, en se concentrant plus sur la canule. Une fois après avoir atteint le point le plus postérieur, le fil de suture est ensuite remonté et enfilée sur la canule une fois de plus. Ceci assure la fermeture de la plaie et évite correcte de la canule / tube de travail à travers la peau.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System at JoVE.com

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Nous décrivons une méthode pour cibler les médicaments pour le système nerveux central soit par l&#39;implantation d&#39;un cathéter ou d&#39;effectuer une injection en bolus dans le ventricule latéral droit chez la souris. Nous nous concentrons particulièrement sur la prestation des oligonucléotides antisens. Cette technique est facilement adaptable à d&#39;autres médicaments et à des rats.

Livraison intraventriculaire directe des médicaments pour le système nerveux central rongeurs

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

direct-intraventricular-delivery-drugs-to-rodent-central-nervous

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Pharmacotherapy of Psychosis and Mania

SCIENTISTS IN ACTION

59.7K vues.  Washington University in St. Louis School of Medicine. Nous décrivons une méthode pour cibler les médicaments pour le système nerveux central soit par l'implantation d'un cathéter ou d'effectuer une injection en bolus dans le ventricule latéral droit chez la souris. Nous nous concentrons particulièrement sur la prestation des oligonucléotides antisens. Cette technique est facilement adaptable à d'autres médicaments et à des rats.

Vidéo: Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

Drug Delivery systémique et locale pour traiter les maladies du système nerveux central dans les modèles rongeurs

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Recherche

Neurosciences

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagerie multimodale d&#39;implantation de cellules souches dans le système nerveux central de souris

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

La production de vecteurs lentiviraux pour les cellules de transduction du Système Nerveux Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Étiquetage des cellules isolées dans le système nerveux central des<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Un paradigme d&#39;enquêter sur les blessures du système nerveux central de réparation de<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

En Interrogation in vivo de système nerveux central Translatome par polyribosome fractionnement

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing optique du système nerveux central de souris utilisant CLARITY passive

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Computerized Test Battery to Study Pharmacodynamic Effects on the Central Nervous System of Cholinergic Drugs in Early Phase Drug Development

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for further development of new compounds. A computerized and thoroughly validated battery of neuropsychological and neurophysiological tests has been shown to be sensitive to detect drug-induced effects of multiple new and existing compounds. The test battery covers the main CNS domains, which have been shown to respond to drug effects and can be repeatedly administered following drug administration to characterize the concentration-effect profile of a drug.
The standard tests in the battery are saccadic eye movement, smooth pursuit eye movement, the Bowdle visual analog scale (VAS), the Bond and Lader VAS, body sway, adaptive tracking, visual verbal learning, and quantitative electroencephalography (qEEG). However, the test battery is adaptive in nature, meaning that it can be composed and adjusted with tests fit to investigate specific drug classes, or even specific receptors.
Showing effects of new cholinergic drugs designed to have a pro-cognitive outcome has been difficult. The pharmacological challenge model is a tool for early proof-of-pharmacology. Here, a marketed drug is used to induce temporary and reversible disease-like symptoms in healthy subjects, via a pharmacological mechanism related to the disease that is targeted as indication for the new compound. The test battery was implemented to investigate the potential of the nicotinic receptor antagonist mecamylamine to be used as a challenge model for cholinergic dysfunction, as seen in neurodegenerative disorders.
A worsening of scores in a dose dependent manner on the visual verbal learning test (VVLT; a test for learning and memory abilities) and the adaptive tracking test (a measure of visuomotor control and arousal), in particular, showed that the test battery is sensitive to showing acute pharmacodynamic effect after administration of anti-cholinergic drugs.

A validated computerized battery of neuropsychological and neurophysiological tests is used to study pharmacodynamic effects on the central nervous system of newly developed drugs in early phase development. To demonstrate the test battery, the acute effects of mecamylamine and the reversal of these effects by two agonist drugs are described.

Une batterie de tests informatisés pour étudier les effets pharmacodynamiques sur le système nerveux Central des drogues cholinergiques dans la Phase précoce Drug Development

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Enregistrement électrophysiologique de l’activité du système nerveux Central du troisième stade de Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...