La convection a amélioré la livraison, ou CED, des vecteurs viraux optogénétiques chez les primates non humains permettra aux chercheurs de manipuler l’activité neuronale à grande échelle pour comprendre les calculs et les comportements neuronaux complexes. Avec la DEC, nous pouvons atteindre une forte expression optogénétique dans de grandes régions du cerveau des primates avec seulement quelques injections en peu de temps par rapport aux méthodes traditionnelles. La résonance magnétique ou l’implantation compatible de chambre de MR est exécutée utilisant la pratique standard dans les chirurgies non humaines de primate, la procédure est décrite en détail dans le protocole de texte et décrite brièvement dans cette vidéo.
Après la sédation animale, le positionnement et l’incision initiale tel que décrit dans le protocole de texte, créez une craniotomie circulaire pour couvrir les trajectoires préplanées pour les injections à l’aide d’une tréphine. Créer une indentation au centre de la craniotomie planifiée suffisamment profondément dans le crâne pour ancrer la tréphine en utilisant le point de centrage réglable de la tréphine. Une fois que le centre a été fait, abaissez la tréphine sur le crâne et faites pivoter la tréphine dans le sens des aiguilles d’une montre et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre tout en appliquant une pression vers le bas jusqu’à ce que la calotte osseuse puisse être enlevée avec des forceps.
Après avoir soulevé la dura comme détaillé dans le protocole de texte, couper la dura du centre au bord de la craniotomie et continuer le long du bord avec de fines ciseaux ophtalmiques. Monter la convection cylindrique sur mesure améliorée livraison MR chambre compatible avec le crâne sur le dessus de la craniotomie pour fournir un soutien canule pendant l’infusion de sorte que la courbure de la bride de chambre s’aligne bien avec la courbure du crâne. Fixez les implants au crâne à l’aide de vis en plastique et d’acrylique dentaire ou de quelques vis en titane.
Peu de temps après l’implantation de la chambre compatible MR et l’insertion de la grille d’injection de canule dans la chambre, remplissez la grille de 0,9% salin pour visualiser les emplacements d’injection via des images anatomiques MR. Remplissez également les cavités de chambre avec de la mousse de gel absorbable stérile humide pour maintenir l’humidité du cerveau. Couvrir la peau et le cylindre d’un drapé stérile d’incise antimicrobienne pour maintenir la stérilité des cylindres pendant le transport et les perfusions MR.
Placez une capsule de vitamine E pour marquer le haut de la grille d’injection pour une identification positive. Pendant que l’animal reste intubé, détachez le tube entérachéal du circuit d’anesthésie et rattachez-le à une machine portative compatible MR isoflurane. Transportez l’animal au scanner IRM.
Acquérir des images T1 pour calculer la distance par rapport au haut de la grille d’injection et à la surface corticale. La capsule de vitamine E est clairement visible dans les images T1 et doit être utilisée comme marqueur pour le haut de la grille d’injection. Acquérir des images T2 pour déterminer les guides de canule optimaux pour chaque site en fonction du site ciblé d’infusion.
La grille de canule est remplie de solution saline qui est mieux visible dans les images T2. À l’aide du logiciel d’imagerie MR, faites défiler les plans coronal et sagittal pour trouver l’emplacement cible de l’infusion. Après avoir décongelé le vecteur viral pendant quelques heures à température ambiante, mélanger le vecteur viral avec l’agent de contraste MR gadoteridol par pipette ou mélange vortex.
Chargez le virus mélangé dans un tube IV haute pression de 0,2 millilitre. À l’aide d’un tube IV haute pression, connectez une longue ligne d’extension à une seringue compatible MR de trois millilitres et amorce avec de la solution saline. Connectez l’autre extrémité du tube à longue extension au tube IV de 0,2 millilitre chargé du virus.
Attachez ensuite la canule résistante au reflux avec une pointe en gradins d’un millilitre à l’extrémité distale de cet assemblage avec un connecteur cathéter de style pince. Enfin, placez la seringue dans une pompe compatible MR. À l’aide des images mr anatomiques de base obtenues, sélectionnez l’emplacement de la grille d’injection de canule et la profondeur d’insertion nécessaires pour atteindre le site de perfusion cible.
Marquer la profondeur d’insertion sur la canule à l’aide de ruban stérile. Commencez l’infusion à raison d’un microlitre par minute et validez visuellement l’écoulement du fluide dans la ligne d’infusion en observant l’éjection du liquide de la pointe de la canule. Insérez la canule manuellement à travers la grille d’injection à la profondeur cible tout en maintenant le flux dans la ligne de perfusion car cela empêchera le tissu pénétré d’obstruer la canule pendant l’insertion.
Maintenant acquérir rapide flash T1 pondérées images pour la surveillance en ligne de l’infusion vecteur viral. Après avoir infusé environ 10 microlitres du vecteur de sorte qu’assez de virus est infusé pour détecter dans le scanner MR, obtenir des images MR pour vérifier le placement correct de la canule comme en témoigne la propagation observée du virus. Si la profondeur de la canule insérée est incorrecte, ajustez la profondeur en conséquence ou retirez lentement la canule et reemptez l’insertion.
Surveillez l’infusion par guidage d’images MR en ligne. Augmentez le taux d’infusion à cinq microlitres par minute d’un microlitre par minute toutes les quelques minutes. Il est important d’augmenter le taux de perfusion lentement et de ne pas dépasser cinq microlitres par minute car des taux de perfusion élevés pourraient causer des lésions tissulaires.
Après avoir infusé environ 40 microlitres du vecteur viral, commencer à réduire le taux d’infusion d’un microlitre par minute étapes. Arrêter l’infusion après l’injection d’environ 50 microlitres. Laisser la canule en place pendant dix minutes.
Retirez lentement la canule du cerveau et passez à l’endroit suivant. Couvrir le cylindre d’un drapé stérile à la fin des injections avant le transport des animaux, puis le ramener à la salle d’opération. Les analyses histologiques sur les sections coronaires périodiques révèlent l’expression optogénétique à grande échelle autour des emplacements de perfusion.
Montré ici est l’image coronale de référence MR et la propagation de l’agent de contraste après l’infusion pour la même tranche coronale MR. Une section de tissu coronal est montrée à peu près la même. La coloration à la peroxyde reflète l’expression de la protéine fluorescente jaune ou du journaliste de l’EYFP.
Un bon alignement est observé entre la zone d’expression EYFP, mesurée avec l’épifluoréscense de surface et avec la coloration histologique. Il s’agit notamment de la région de propagation vectorielle estimée à partir d’images MR. Les points blancs indiquent les sites d’injection et toute la région noire représente la zone exposée par la craniotomie.
Montré ici est une image de grossissement faible des sections coronales tachées avec anticorps anti GFP montrant l’aspect latéral médial de l’expression de YFP dans le cortex somatosensory. La pointe de flèche noire indique l’emplacement de la piste de canule. Le tissu adjacent est montré à un grossissement plus grand pour montrer la distribution laminaire des cellules positives de YFP.
Les régions densément peuplées des cellules positives du PJ sont situées principalement dans les couches deux à trois et cinq à six. L’agrandissement ultérieur révèle les cellules pyramidales typiques dans les couches deux à trois, la couche cinq, et la couche six. Il est important de laisser la canule en place pendant 10 minutes après l’arrêt du débit.
Cela permettra de s’assurer que le virus a percolé dans le tissu neuronal ciblé environnant. La DECE est une approche efficace pour atteindre des niveaux d’expression uniformément élevés dans les grandes régions du cerveau chez les mammifères. Il a le potentiel d’élargir notre compréhension des circuits neuronaux et de la connectivité.
Après la transduction virale par CED, les expériences suivantes de stimulation optogénétique peuvent être jumelées avec l’enregistrement électrique et les essais comportementaux pour révéler la dynamique complexe de circuit dans le cerveau. Cette technique a déjà été utilisée par Yazdan-Shahmorad et ses collègues en 2018 dans laquelle la modulation neuronale optogénétique a été utilisée pour induire des changements de connectivité à l’échelle du réseau dans le cortex moteur sensoriel.
