L’interaction protéine-protéine dans la transcription a été traditionnellement étudiée à l’aide de la dialyse por. Cependant, la dialyse por est purement quantitative. Nous utilisons l’interférométrie biocouche, ou BLI, pour surmonter ce problème.
Par rapport à Por dan, BLI détecte l’association en temps réel et la dissociation entre partenaires de liaison. Il génère également des paramètres cinétiques quantitatifs, qui sont indicatifs des mécanismes d’interaction. La technologie BLI peut sembler intimidante, mais il n’est pas difficile d’apprendre À utiliser cette technologie, il faut avoir accès à un instrument BLI et au logiciel associé.
Cette vidéo vous permettra de vous adapter facilement à la technologie BLI. Environ 10 minutes avant le début d’un essai, pipette 200 microlitres du tampon BLI dans un tube PCR. Retirez un biocapteur NTA nickel de l’emballage d’origine en tenant la grande partie du biocapteur à l’aide d’une main gantée.
Placez le biocapteur sur le tube PCR de telle sorte que seule la pointe en verre du biocapteur soit immergée dans le tampon BLI. Gardez la pointe du biocapteur immergée pendant au moins 10 minutes pour assurer une hydratation complète. Allumez la machine Blitz.
Assurez-vous que la machine est connectée à l’ordinateur via un port de sortie de données USB à l’arrière de la machine. Sur l’ordinateur, ouvrez le logiciel associé et cliquez sur Advanced Kinetics sur le côté gauche de l’écran. Dans le logiciel, tapez toutes les informations appropriées sur l’expérience sous chaque rubrique respective.
Cliquez sur Biosensor Type et choisissez Nickel NTA dans le menu dropdown. La durée de chaque étape peut être modifiée par défaut au besoin. Pour des résultats optimaux, utilisez un minimum de 30 secondes pour la ligne de base initiale et la ligne de base et 120 secondes pour l’association et la dissociation.
Retirez le biocapteur NTA de nickel hydraté du tube PCR et fixez-le sur la monture du biocapteur sur la machine en glissant la grande partie du biocapteur sur la monture. Placez un tube de microcentrifugeuse noire de 0,5 millilitre dans le support de tube de la machine et pipette 400 microlitres de tampon BLI en elle. Fermez le couvercle de la machine de telle sorte que la pointe du biocapteur soit immergée dans le tampon dans le tube de microcentrifugeuse.
Cliquez ensuite sur le logiciel pour commencer à enregistrer la ligne de base initiale. Une fois l’étape de base initiale terminée, ouvrez la couverture de la machine. Déplacez le curseur vers la droite, de sorte que le porte-gouttes est situé devant la flèche noire.
Pipette quatre microlitres d’un ligand dialysé son marqué sur le porte-gouttes et fermer le couvercle de la machine, qui va automatiquement commencer à enregistrer l’étape de chargement. Une fois l’étape de chargement terminée, ouvrez le couvercle de la machine. Déplacez le curseur vers la gauche, de sorte que le support du tube est une fois de plus situé en face de la flèche noire.
Fermez le couvercle de la machine et assurez-vous que la pointe du biocapteur est immergée dans le tampon BLI du tube dans le support du tube. La machine et le logiciel commenceront automatiquement à enregistrer l’étape de base. Une fois l’étape de base terminée, ouvrez le couvercle de la machine.
Retirez le porte-gouttes et nettoyez-le en arrosant n’importe quelle protéine et rincez-la avec de l’eau doublement déionisée pour un total de cinq fois. Utilisez un lingette de tissu pour nettoyer la surface du porte-gouttes après le dernier lavage. Replacez le porte-gouttes sur la machine.
Déplacez le curseur sur la machine vers la droite, de sorte que le porte-chute est une fois de plus situé en face de la flèche noire. Pipette quatre microlitres d’un analyte dialysé sur le porte-gouttes et fermer le couvercle de la machine, qui va automatiquement commencer à enregistrer l’étape de l’association. Une fois l’étape de l’association terminée, ouvrez la couverture de la machine.
Déplacez le curseur sur la machine vers la droite, de sorte que le support du tube est une fois de plus situé en face de la flèche noire et fermer le couvercle de la machine, qui va automatiquement commencer à enregistrer l’étape de dissociation. Une fois l’étape de dissociation terminée, ouvrez le couvercle de la machine et retirez le porte-gouttes et le support du tube. Rincer soigneusement les deux à l’eau double déionisée pour laver toute protéine.
Retirez le biocapteur et jetez-le en toute sécurité. Répétez ces étapes pour la même paire d’analyte ligand en utilisant différentes concentrations d’analyte. Une fois toutes les courses terminées, enregistrez les données sur le logiciel en cliquant sur Fichier et Enregistrer l’expérience comme sur le côté gauche de l’écran.
Sous le titre Exécuter les données, sélectionnez Correction d’étape et ajustement un à un et cliquez sur Analyser pour générer des données cinétiques. Pour extraire les données quantitatives dans une feuille de travail et générer des graphiques, cliquez sur Export to CSV et enregistrez les données enregistrées sous forme de fichier CSV. Ouvrez le fichier CSV à l’aide d’un logiciel de feuille de calcul.
GrgA pleine longueur est faite de 288 acides aminés. Comme indiqué ici, une région moyenne de 28 acides aminés lie Sigma 28 directement. Ici, la région moyenne marquée avec un terminal final His-tag a été utilisé comme ligand, qui a d’abord été immobilisé à la pointe d’un biocapteur nickel NTA.
Les enregistrements d’expériences avec trois concentrations différentes d’analyte commençant chacun 30 secondes avant la liaison ligand et se terminant deux minutes après le début du dernier lavage sont montrés. La visualisation améliorée de l’association et de la dissociation d’analyte de ligand est montrée après suppression des valeurs dans les deux premières étapes et réinitialisation de la ligne de base. Après le lavage non lié et terminal His-marqué GrgA 138 à 165 hors du biocapteur, l’association en temps réel avec l’analyte a été enregistrée suite à l’ajout de Sigma 28.
Enfin, la dissociation en temps réel a été enregistrée après le lavage. Avant les analyses BLI, le glycérol est retiré des ligands et des analytes. Nous recommandons que BLI soit effectué peu de temps après la dialyse comme discuté dans le texte.
Après avoir caractérisé les interactions protéine-protéine dans la transcription avec BLI, on peut étudier comment l’interaction affecte l’initiation de transcription, l’allongement, et ou la terminaison.
