Seules et seules les protéines contraignantes contrôlent de multiples processus biologiques. Cette méthode FLAG-Biotin CLIP-seq, donc pour profiler globalement l’arrangement spécial et temporel des ARN et des RBPs dans les cellules mammifères. Cette méthode permet la détection efficace des ARN directs liés aux protéines sans SDS-PAGE et les procédures de transfert de membrane.
Par rapport à clip-seq traditionnel est sans isotopes et il ne nécessite pas d’anticorps spécifiques aux protéines. Commencez par placage d’environ 3 millions de cellules souches embryonnaires de souris dans une plaque de 10 centimètres et les incuber pendant la nuit. Le lendemain, retirer le milieu avec un vide et traiter les cellules avec deux millilitres de 0,25% trypsine EDTA pendant deux minutes à température ambiante.
Étanchez la trypsine avec quatre millilitres de moyenne MESC fraîche, et transférez les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez-les à 300 fois G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius et retirez le supernatant. Suspendre les cellules en quatre millilitres de PBS froid et les transférer à la plaque de 10 centimètres pour la liaison croisée.
Rayonnez les cellules avec une lumière UV de 254 nanomètres, puis transférez les cellules croisées dans un tube de 15 millilitres. Faites tourner ces cellules à 300 fois G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius, puis retirez le supernatant et lysez les cellules avec 500 microlitres de tampon A préparés selon les directives manuscrites. Transférez les cellules dans un tube de 1,5 millilitre sans RNAse et incubez-les à quatre degrés Celsius avec rotation douce pendant 30 à 60 minutes.
Traiter le lysate avec 30 microlitres de DNAse 1 à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, arrêtez la réaction en ajoutant quatre microlitres de 0,5 molaire EDTA. Faites tourner la pastille insoluble en centrifugant à 12 000 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, et transférez le supernatant dans un nouveau tube pré-refroidi de 1,5 millilitre.
Transférer la cellule lysate dans des perles FLAG prééquilibrées et incuber l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant la rotation de deux à quatre heures. Après l’incubation, centrifuger les perles pendant deux minutes à 3000 fois G et enlever le supernatant. Ajouter 500 microlitres de tampon A à l’échantillon, et incubé à 4 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis faire tourner les perles et enlever le surnatant.
Répétez le lavage avec le tampon A, suivi de deux lavages avec une elute tampon B.To pré-réfrigérée avec un peptide FLAG de trois X, préparez la solution d’élitution telle que décrite dans le manuscrit du texte et faites tourner les perles FLAG. Retirez le supernatant avec une pointe de pipette à extrémité étroite et ajoutez 200 microlitres des trois solutions d’élitution X FLAG à chaque échantillon. Incuber les échantillons pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius avec rotation douce.
Puis faites tourner les perles pendant deux minutes à 3000 fois G.Transférer le supernate dans un tube frais et répéter l’élitution deux fois. Économisez 5 % des évasés pour l’analyse des taches occidentales ou la coloration argentée pour vérifier l’efficacité de l’immunoprécipitation FLAG. Transférer les élitants tirés sur des perles de streptavidine préparées et faire pivoter les échantillons doucement à quatre degrés Celsius pendant une à trois heures ou toute la nuit.
Ensuite, recueillir les perles sur un support magnétique et enlever le surnatant. Laver les perles deux fois avec 500 microlitres de Tampon C avec rotation douce pendant cinq minutes par lavage. Ensuite, lavez les perles deux fois avec 500 microlitres de Buffer D, et deux fois avec 500 microlitres de tampon PNK glacé, en recueillant les perles sur le support magnétique et en enlevant le supernatant entre les lavages.
Pour effectuer la digestion partielle de l’ARN, ajouter 100 microlitres de solution MNA à chaque échantillon et vortex réglé à 37 degrés Celsius avec un mélangeur thermique pendant 10 minutes. Recueillir les perles avec un support magnétique pendant 30 secondes et enlever le surnatant. Ensuite, lavez-les avec le tampon PNK-EDTA, le tampon C et le tampon PNK selon les instructions manuscrites.
Recueillir les perles avec le support magnétique et enlever le tampon. Ajouter ensuite le mélange de réaction CIP et vortexer les perles à 37 degrés Celsius à l’aide d’un mélangeur thermique pendant 10 minutes. Lavez rapidement les perles deux fois avec 500 microlitres de tampon PNK EDTA glacé, suivi de deux lavages avec 500 microlitres de tampon PNK glacé.
Après les lavages, ajouter 40 microlitres de trois mélanges de ligature linker premier aux perles, et les vortex à 16 degrés Celsius avec un mélangeur thermique pendant trois heures ou toute la nuit. Une ligature efficace du lien avec les alliés est essentielle pour cette expérience. Vérifiez le tube de réaction de temps en temps pour s’assurer que ceux-ci ne précipitent pas pendant la ligature.
Après l’incubation, répéter les lavages avec des tampons PNK EDTA et PNK, ajouter 40 microlitres de PNK mélangés aux perles, et les vortex à 37 degrés Celsius avec le mélangeur thermique pendant 10 minutes. Lavez les perles avec des tampons PNK EDTA et PNK, puis procédez à l’isolement de l’ARN tel que décrit dans le manuscrit du texte. Comparé à flag-médié ou streptavidin médié une purification d’affinité d’étape, purification de tandem flag-biotine enlevé presque toutes les protéines purifiées de noyau, évitant la contamination des interactions indirectes d’ARN de protéine.
LIN28 et WDR43, FBIo CLIP-seq a été effectué à l’aide de cellules SOUCHES embryonnaires de souris. Au total, environ 7,7 millions et 2,2 millions de lectures uniques ont été récupérées pour LIN28 et WDR43 respectivement. La comparaison des vues de la voie montre différents modèles de liaison dans le locus pré-rRNA de la RN45.
Les sites reliés entre les deux sur le motif GGA G de l’ARN pré-let7-g par LIN28, FBIo CLIP-seq ou identifiés. En outre, des motifs enrichis d’ARN dans les sites de liaison, et le pourcentage de nucléotides mutés dans différents types de mutations ont été déterminés. Montrant que LIN28 préfère se lier au nucléotide génétique.
Eh bien, à 22h00, ce protocole, il est important de confirmer l’efficacité de l’immunoprécipitation pour s’assurer que les complexes protéiques seulement ont été purifiés avec succès.
