Ce protocole cible la question limitée de l’approvisionnement en organes de transplantation en facilitant l’évaluation des différentes stratégies de conditionnement cardioprotecteur pour permettre l’utilisation de cœurs donnés après la mort circulatoire. Placer l’animal sur un coussin chauffant réglé à moyen. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des pieds chez un rat adulte anesthésié, insérez une sonde rectale de température.
Fixez un capteur transdermique d’oxymètre d’impulsion à une patte arrière, et couvrez le rat avec un tampon absorbant pour maintenir la température corporelle. Faire une incision de trois à quatre centimètres de la peau midline dans le cou, et utiliser des ciseaux incurvés pointe émoussée pour émousser disséquer le tissu sous-cutané, pour exposer le muscle sternohyoid droit. À l’aide de forceps non traumatiques, déplacez le muscle latéralement jusqu’à ce que l’artère carotide droite, la veine jugulaire et le nerf vague soient identifiés.
Utilisez des ciseaux pour séparer soigneusement le nerf vague de l’artère carotide. Injecter 2000 unités internationales par kilogramme d’héparine dans la veine jugulaire droite, en appliquant une pression sur le site d’injection après la rétractation de l’aiguille pour éviter les fuites de sang. Utilisez des forceps incurvés pour passer deux sutures de soie 5-0 autour de l’artère carotide.
Attachez fermement la suture distale pour occluser l’artère carotide à l’aspect supérieur de l’artère exposée, en gardant la suture proximale déliée, et placez le rat sous un microscope stéréo. Utilisez ensuite des ciseaux de microchirurgie pour faire soigneusement une incision d’un millimètre au-dessus de la paroi antérieure de l’artère carotide, et insérez un cathéter intraveineux fermé de 22 calibres et d’un pouce vers l’arc aortique. L’utilisation d’outils de grossissement et de microdissection est fortement recommandé pour ces étapes.
Un champ propre peut être réalisé en tensionnant la suture proximale pour éviter le saignement. Le don cardiaque est nécessaire pour assembler l’appareil ex vivo cardioplégie. Pour initier le protocole DCD, d’abord extuber l’animal, puis utiliser des pinces à moustiques pour serrer la trachée, en commençant la phase agonale.
Commencez à compter l’ESPRIT fonctionnel lorsque la pression artérielle systolique maximale descend en dessous de 30 millimètres de mercure ou d’asystole ou de fibrillation ventriculaire apparaît, selon la première. À la fin de WIT, effectuer une sternotomie médiale, en gardant le thorax ouvert avec un rétracteur Alm si nécessaire. Séparez le cœur des veines pulmonaires et d’autres structures thoraciques pour compléter la cardiectomie.
Submergez immédiatement le cœur dans la solution krebs glacée pour un transport rapide vers le système ex vivo. Utilisez une suture en soie 2-0 pour fixer étroitement l’aorte à l’appareil Langendorff, puis ouvrez le robinet d’arrêt. Maintenant, ouvrez complètement le flux à la canule, et commencer le temps de reperfusion initiale et de stabilisation.
Faites pivoter le cœur de sorte que l’atria est face au capteur de pression, et disséquer les veines pulmonaires pour élargir l’ouverture ventriculaire gauche auriculaire si nécessaire. Ensuite, insérez un ballon en latex relié à un capteur de pression, en vous assurant que le ballon est entièrement positionné à l’intérieur du ventricule. Remplissez lentement le ballon de solution saline jusqu’à ce que la pression diastolique finale atteigne 15 millimètres de mercure.
Insérez l’électrode arpentante dans la face antérieure du cœur sans percer les vaisseaux coronaires. Une fois que les battements spontanés sont observés, réglez le rythme à 300 battements par minute. Après 10 minutes de stabilisation, lancez l’enregistrement continu de mesure de la pression intraventriculaire pour commencer la phase de reconditionnement et d’évaluation.
Après une heure, retirer le cœur de l’appareil Langendorff et utiliser une lame droite en acier à haute teneur en carbone pour enlever les airs. Avec le ventricule droit orienté vers le bas, couper des tranches ventriculaires transversales d’un à deux millimètres d’épaisseur. Exciser le ventricule droit de la troisième tranche de tissu, et casser geler le ventricule gauche pour les analyses biochimiques en aval.
Submergez les sections restantes dans la solution 5% TTC fraîchement préparée dans PBS pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, lavez les échantillons deux fois dans du PBS frais et submergez les échantillons dans du PBS frais pour l’imagerie. Les tissus viables apparaîtront de couleur rouge brique.
Après l’extubation, la pression artérielle diminue rapidement dans un modèle prévisible et le temps prévu à la mort est inférieur à cinq minutes. Ici, la pression moyenne par rapport aux courbes de temps au début du reconditionnement après zéro, 10 et 15 minutes de WIT sont affichées. La fonction contractile s’améliorera au fil du temps, l’utilisation de courtes périodes de WIT permettra à la contractilité de revenir à la normale, et les dommages morphologiques ne seront pas détectables.
L’utilisation d’un agent de conditionnement ajouté avec la cardioplégie et à la phase de stabilisation a montré que les dommages générés par 15 minutes de WIT dans ce modèle sont agréables à la modulation par des agents cardioprotecteurs. Cette technique permet un contrôle total de toutes les variables pertinentes et des tests pharmacologiques et non pharmacologiques d’intervention et peut être reproduite dans des modèles plus grands, facilitant ainsi la traduction clinique.
