Neisseria meningitidis est l’une des causes les plus courantes de septicémie et de méningitidis parmi la population humaine dans le monde entier, et la bactérie est limitée à l’hôte humain. Dans ce protocole expérimental, nous décrions la procédure sur mesure pour l’induction du méningitidis méningococcique dans un modèle de souris basé sur l’inoculation intra-isternale des bactéries. Ce modèle murin reproduit les événements pathologiques caractéristiques de la méningite méningococcique comme maladie humaine grave.
Ainsi, il représente un outil utile pour évaluer l’interaction hôte-pathogène et pour analyser le mécanisme pathogénétique responsable de cette maladie mortelle. Le modèle d’infection pourrait être utile non seulement pour évaluer la stratégie thérapeutique innovatrice pour empêcher la réplication de bactéries directement dans CSF, mais également pour analyser l’efficacité de l’immunothérapie passive possible contre des agents pathogènes humains. La technique nécessite la phase de formation pour garantir le succès non seulement de l’inoculum intracisténal, mais plus généralement de l’induction de la maladie.
Roberta Colicchio et Chiara Pagliuca en tant que chercheurs, et Elena Scaglione en tant qu’étudiante au doctorat, seront les suivantes : Roberta Colicchio et Chiara Pagliuca en tant que chercheuses. Pour commencer, choisissez une seule colonie à partir d’une culture fraîche neisseria meningitidis sur la plaque d’agar gonococcique complétée par un supplément de polybitox de 1% et inoculer en bouillon GC de 10 millilitres. Toutes les procédures qui impliquent l’utilisation de méningocoques doivent être effectuées sous un coffret cube de biosécurité à écoulement laminaire.
Faire croître les bactéries à 37 degrés Celsius dans un incubateur de secousses orbitales à 220 RPM et continuer à vérifier la densité optique de la culture à différents moments avec un spectrophotomètre. Développer la culture jusqu’à ce qu’elle atteigne OD600 de 0,7 correspondant à la phase exponentielle précoce. Une fois cette densité optique obtenue, faire des stocks congelés en ajoutant 10% de glycérol et en distribuant un millilitre de la culture dans les flacons cryo.
Conserver les flacons à 80 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Avant l’infection, décongeler les bactéries congelées à température ambiante, puis transférer dans un tube de centrifugeuse dans une centrifugeuse pendant 15 minutes à 1500xG Retirer le supernatant et suspendre à un millilitre de bouillon GC frais contenant cinq milligrammes par kilogramme de dextran de fer. Avant de commencer l’expérience, pesez les animaux et évaluez leur température corporelle.
Éraflez l’animal du cou vers le bas et désinfectez l’abdomen avec un éthanol à 70%. Environ 2 heures avant l’infection, à l’aide d’une aiguille de calibre 25, injecter du fer dextran intraperitoneally dans le quadrant inférieur droit de l’abdomen. Après anesthésier l’animal, vérifiez la profondeur de l’anesthésie en confirmant l’absence de réponse à la douleur en pinçant l’avant.
Après avoir placé la souris sur l’armoire d’écoulement laminaire, placez-la dans un décubitus sternal et étirez soigneusement les membres et la colonne cervicale pour maintenir la colonne vertébrale en position droite. Pour maintenir une suspension bactérienne uniforme, mélangez-la doucement avant de la charger dans une seringue avec une aiguille de calibre 30 de huit millimètres. Désinfecter la tête avec un éthanol à 70%.
Placez l’animal dans la couchée latérale, tirez les oreilles hors de la voie, et fléchissez le cou modérément. Assurez-vous que la ligne médiane du cou et la tête sont en position parfaitement parallèle au dessus de la table. Ensuite, touchez les ailes de l’atlas, en vous assurant qu’elles se chevauchent et sentez l’indentation naturelle sur la ligne médiane où l’aiguille est la plus susceptible d’entrer dans le trou occipital.
Remplissez une seringue d’une aiguille de calibre 30 de 8 millimètres avec la dose bactérienne sous-létale établie de méningocoques ou de dextran de fer complété bouillon GC comme contrôle dans un volume total de 10 microlitres. Utilisez l’aiguille pour identifier le point d’injection, puis injecter le contenu de la seringue à la cisterna magna des souris par un trou occipital bavure. Jeter la seringue et l’aiguille en toute sécurité après l’injection.
Placez l’animal dans la cage sous une armoire à écoulement laminaire. Attendez l’éveil et le rétablissement complet du mouvement et procédez à la survie de l’animal sur les animaux infectés, tel que décrit dans le protocole. Après anesthésier la souris, désinfecter la poitrine avec un éthanol à 70%.
À l’aide d’une aiguille de calibre 25, retirer de 600 à 700 microlitres de sang par perforation cardiaque de la cavité thoracique. Recueillir le sang dans un tube contenant du citrate de sodium à 3,8 % et le conserver à 80 degrés Celsius pour l’évaluation ultérieure du nombre de cellules bactériennes viables. Mentez la souris euthanasiée dans la position supine.
À l’aide de ciseaux et de forceps couper la fourrure le long du plan sagittal du corps. Avec des épingles, fixer la peau avec la fourrure sur les côtés du corps. Utilisez des ciseaux pointus pour couper la membrane péritonéale.
Ensuite, avec des ciseaux et des forceps jetables, exciser les organes, tels que la rate et le foie, et mettre chacun dans une boîte de Pétri stérilisation séparée avec un millilitre de bouillon GC complété par 10% glycérol. À l’aide d’un piston d’une seringue de cinq millimètres, homogénéisez les organes mécaniquement à température ambiante pendant environ deux à trois minutes jusqu’à ce que la suspension à cellule unique soit formée et transférez-la sur un flacon cryo scurdent. Placez le tube immédiatement sur la glace sèche.
Faire des plaques d’agar GC avec des antibiotiques et les sécher avant de les utiliser à 37 degrés Celsius pendant deux à trois heures. Préparer 10 dilutions complètes en série des échantillons dans le bouillon GC de chaque tissu homogénéisé. Plaquez-les sur des plaques d’agar GC et couvez pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
Avec 70% d’éthanol, désinfecter la tête d’une souris euthanasiée. À l’aide de petits ciseaux chirurgicaux et d’un forceps en acier à pointe fine, resséquez la fourrure et la peau de la tête enlevée, puis avancez vers le haut du crâne afin de voir clairement les sutures et de guider l’ouverture du crâne. Pour ouvrir le crâne, insérez la pointe de minuscules ciseaux à travers le magnum foramen.
Couper vers le centre du crâne et à travers la ligne médiane de l’os pariétal de l’autre côté du crâne et couper délicatement le long du membre latéral de la suture lambdoid. À l’aide de forceps à pointe fine, à partir du coin pariétal postérieur, soulevez le crâne et tirez-le en diagonale vers le haut pour découvrir le cerveau, en s’assurant que le tissu cérébral n’est attaché à aucun os de la tête lorsque le crâne est soulevé. Utilisez des forceps jetables pour enlever tout tissu conjonctif entre le crâne et le cerveau et ne laissez pas le tissu cérébral sécher.
Utilisez des forceps jetables pour placer immédiatement le cerveau dans une boîte de Petri avec un millilitre de bouillon GC complété par 10% de glycérol. Utilisez le piston d’une seringue de cinq millilitres pour homogénéiser le cerveau mécaniquement à température ambiante pendant environ deux à trois minutes jusqu’à ce qu’une suspension à cellule unique soit formée. Transférer la suspension dans un tube stérile de 2 millilitres et la conserver à 80 degrés Celsius pour l’évaluation du dénombrement des cellules bactériennes viables ultérieurement.
La survie des souris infectées par des souches neisseria meningitidis de type sauvage ou cssA de type sauvage ou cssA a été évaluée. La dose létale médiane pour la souche de type sauvage correspondait au défi méningococcique de 10 à la 4e CFU. Alors que le taux de mortalité de 10 à la 5e CFU était égal à 83,4% et 100% avec 10 à la 5ème dose de CFU.
Afin d’obtenir la dose létale médiane pour la souche mutante défectueuse cssA, une dose de 10 à la 8e CFU était nécessaire et se quantités 1000 fois plus élevées que la souche de type sauvage. Après l’injection, il y avait une augmentation rapide des bactéries de type sauvage dans le tissu cérébral atteignant le sommet vers 24 heures après l’infection. Dans le cerveau des souris infectées par la souche mutante, les comptes viables ont diminué progressivement au fil du temps.
En outre, 33,3% des souris infectées mutantes ont montré le dégagement bactérien du site d’infection, contrairement aux animaux infectés de type sauvage. 48 heures après l’infection, le mutant défectueux de cssA a été complètement dégagé dans la rate et le foie, tandis que les animaux infectés par la souche sauvage-type ont exhibé une infection persistante. La méthode expérimentale décrite pourrait être utile pour analyser des dommages de cerveau liés à cette maladie mortelle, par son évaluation pathologique, telle que l’immunohistochimie, l’immunofluorescence, et l’analyse cérébrale de saignement.
