Le protocole permet d’évaluer les réponses des hôtes à une variété d’agents pathogènes et de formulations de vaccins. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’évaluation de la charge bactérienne et des réponses immunitaires in vivo, à l’aide d’un modèle animal tractable. Kacy Yount, étudiante diplômée de mon laboratoire, démontre cette procédure.
Pour l’immunisation, confirmer un manque de réponse au pincement des pieds chez une souris anesthésiée de six à douze semaines, et charger une seringue à insuline d’un millilitre, munie d’une aiguille de calibre 28,5 avec un millilitre de 0,1 millilitre du vaccin d’intérêt. Tenir la seringue à un angle de 45 degrés, avec le biseau orienté vers le haut, insérer l’aiguille environ cinq millimètres dans le deltoïde de la souris, et injecter le vaccin. Gardez l’aiguille insérée dans le muscle pendant cinq à dix secondes, puis faites pivoter la seringue à 180 degrés, de sorte que le biseau est orienté vers le bas pour créer un joint, et pour prévenir les fuites de vaccin, avant de retirer lentement l’aiguille du site d’injection.
Ensuite, retournez la souris dans sa cage, avec surveillance, jusqu’à ce qu’elle se rétablisse complètement. Environ deux semaines après avoir stimulé, infecter les souris vaccinées. Saisissez une souris anesthésiée par le scruff du thorax dorsal, derrière les omoplates et le cou, et placez la souris droite pour accéder au nez.
À l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres, appliquez lentement de 20 à 25 microlitres de l’inoculum bactérien d’intérêt pour chaque nare de l’animal, en tenant la souris jusqu’à ce que l’inoculum entier ait été inhalé. Ensuite, livrer un volume égal de PBS stérile à un groupe de souris comme un contrôle négatif. Au point d’extrémité expérimental approprié, placez un côté ventral de souris infecté vers le haut sur un conseil de dissection, et fixez les membres.
Mouiller le corps avec 70% d’éthanol, et utiliser des forceps pour serrer la peau sous l’abdomen au centre du bassin. À l’aide de ciseaux pointus, faire une coupe verticale jusqu’à la mandibule, et disséquer la peau de la paroi péritonéale. Déplacez la peau sur les côtés de la carcasse pour créer un champ dégagé pour la récolte stérile d’organes, et saisissez le péritoine intact sous la cage thoracique, à ou près du foie.
Couper le péritoine vers la cage thoracique pour exposer le tube digestif inférieur, et déplacer le côlon vers la gauche pour révéler la rate. À l’aide de forceps incurvés, saisir la rate et disséquer le tissu conjonctif à l’aide de ciseaux. Placez ensuite la rate dans un tube conique de 15 millilitres contenant 3 millilitres de RPMI, et 5% de sérum bovin fœtal sur la glace.
Utilisez des forceps pour stabiliser la cage thoracique au processus xyphoïde, et coupez le diaphragme. Les poumons doivent se dégonfler et tomber vers la colonne vertébrale. Coupez la cage thoracique sur les côtés pour enlever la cuirasse, et coupez les artères pulmonaires et les veines pour isoler et enlever le lobe supérieur du poumon droit.
Fixer le lobe dans un tube conique de 15 millilitres de formaline tamponnée neutre à température ambiante pendant au moins 24 heures, et isoler les lobes restants des poumons droit et gauche. Placez ensuite les lobes dans un tube conique de 15 millilitres, contenant deux millilitres de 1 % de caséine dans le PBS sur la glace. Utilisez un pipetman d’un millilitre avec pointe pour recueillir le sang remplissant la cavité thoracique, et transférer le sang dans un tube de microcentrifugeuse pré-étiqueté de 1,5 millilitre sur la glace.
Enlever les glandes parotides, sublinguales et submaxillaires et les ganglions lymphatiques qui recouvrent la trachée, et ouvrir et enlever les membranes protectrices entourant la trachée. À l’aide de forceps fins et de ciseaux, séparez soigneusement la trachée de l’œsophage et de tout autre tissu conjonctif du haut des clavicules jusqu’au fond de la mandibule. Utilisez des forceps pour tenir la trachée et couper la trachée au sommet de la clavicule.
Tirez vers le bas de la trachée pour maximiser l’élasticité, et couper la trachée au fond de la mandibule, juste au-dessus du larynx, isolant environ un centimètre de tissu. Placez ensuite l’organe dans un tube de microcentrifugeuse préétiqueté de 1,5 millilitre, contenant 0,3 millilitres de caséine de 1 % dans le PBS sur la glace. Maintenant, tournez la souris pour un accès clair au nez, et pulvériser la tête avec 70% d’éthanol.
Saisissez manuellement l’animal directement derrière le crâne, et utilisez des ciseaux pour couper la chair molle du museau, en commençant par le bas du nez et en se déplaçant vers le haut. Retirez la fourrure, la peau et les moustaches autour du nez, et insérez les extrémités d’une paire incurvée de ciseaux dans les nares avec les courbes pointées vers le bas. Coupez le passage nasal vers les yeux, créant une formation en V.
Ensuite, utilisez des forceps fins pour recueillir le septum nasal, et les tissus mous dans la formation, et placez le tissu dans un tube de microcentrifugeuse pré-étiqueté de 1,5 millilitre contenant 0,3 millilitres de 1% de caséine dans PBS, sur la glace. Pour traiter le tissu pulmonaire, transférez le contenu entier du tube d’échantillon pulmonaire dans un homogénéisateur stérile de Dounce de 15 millilitres, et utilisez un pilon pour homogénéiser le tissu. Dissocier l’échantillon jusqu’à ce qu’il ne reste pas de grosses particules de tissu et remettre la suspension homogénéisée au tube original de 15 millilitres.
Retirer un aliquot de 0,3 millilitre pour le placage des unités de formation de colonies, et recueillir le reste de l’homogénéité par centrifugation. Aliquot 0,5 millilitres de supernatant dans des tubes de microcentrifugeuse pré-étiquetés pour le stockage à 20 degrés Celsius jusqu’à l’analyse de l’expression cytokine par Eliza. Ensuite, diluer en série 0,1 millilitre aliquots de la suspension pulmonaire homogénéisée mis de côté en 0,9 millilitres de PBS stérile par dilution, et utiliser un épandeur triangle stérile pour plaque 0,1 millilitre de chaque dilution empiriquement choisie sur pré-étiqueté 10%Bordet-Gengou plus plaques streptocolycine.
Ici, la densité optique représentative 600 mesures et calculs pour réaliser une suspension bactérienne d’une densité optique, pour préparer un inoculum bactérien dilué cent fois à livrer aux souris, sont montrés. Après sept jours de stimulation antigène vaccinale, les cellules immunisées de la rate du groupe vaccinal combiné produisent de l’interféron gamma et de l’IL17, tout en réduisant considérablement la régulation de l’IL5, favorisant une aide T, une polarisation T 17 de la réponse immunitaire lors d’une infection à coqueluche B. L’énumération par unité de formation de colonies de bactéries récupérées dans les voies respiratoires d’une souris infectée par la coqueluche B peut être utilisée pour évaluer les effets protecteurs du vaccin d’intérêt.
Travaillez aussi rapidement et aussi efficacement que possible afin d’éviter la nécrose tissulaire, et stockez le tissu isolé sur la glace pour préserver la viabilité des bactéries récupérées. La cytométrie du flux ELISpot et l’isolement de l’ADN et de l’ARN peuvent être effectués pour évaluer les cellules immunitaires, la production d’analytes et pour permettre des analyses épigénétiques et transcriptomiques. Lorsque vous travaillez avec des agents infectieux tels que bordetella coqueluche, il est important de se rappeler de porter l’EPI approprié, et de travailler dans un cabinet de biosécurité certifié afin de prévenir la transmission d’agents pathogènes.
Ce protocole détaille l’énumération de cfu des voies respiratoires, particulièrement le pharynx nasal. Répondre aux questions dans les domaines des vaccins et des maladies infectieuses sur le ciblage de la colonisation bactérienne dans le nez.
