Cette technique facilite l’observation en temps réel de l’activité synaptique du calcium comme paramètre physiologique pour les processus cellulaires sous-jacents à l’apprentissage et à la formation de la mémoire chez le melanogaster drosophila. En comparant les réponses neuronales aux odeurs avant et après la formation associative, nous pouvons établir des corrélations directes entre l’activité synaptique et la formation de la trace de mémoire chez les mouches des fruits individuelles. Pour produire des mouches transgéniques de fruit dans lesquelles les neurones spécifiques d’intérêt expriment un indicateur génétiquement codé de calcium croisent les mouches femelles-vierges et mâles portant les constructions désirées de GAL4 et de SAMU, et vieillissent la progéniture femelle jusqu’à trois à six jours après l’éclosion.
Pour préparer une mouche à l’imagerie, utilisez des forceps fins pour placer une mouche anesthésiée de glace dans une chambre d’imagerie préparée sur mesure. À l’aide d’un microscope disséquant pour positionner le thorax et les jambes en contact avec les fils électriques au fond de la chambre, et avec la tête couchée à plat. Fixez la mouche en place avec du ruban adhésif clair, et utilisez une lame chirurgicale de scalpel pour couper une fenêtre dans la bande autour de la tête, laissant l’antenne couverte et seulement la plus grande partie antérieure du thorax exposée.
Utilisez une goupille d’insecte tenue par des mâchoires concaves-convexes pour entourer soigneusement les côtés et l’arrière de la tête avec de la colle de séchage de lumière bleue. Et utilisez une lampe LED émettant de la lumière bleue pour régler la colle. Lorsque la colle est complètement réglée, effacer toute colle résiduelle non durcie de la surface dorsale de la tête de mouche et couvrir la cuticule exposée de la tête avec une goutte de solution de Ringer.
À l’aide d’un couteau à lame très fine, couper à travers la cuticule sur le postérieur de la tête, en commençant par l’ocelli et couper chaque médial latéral vers les yeux pour former un rabat de la cuticule qui peut être facilement arraché à l’aide de forceps. Enlever tout excès de cuticule qui peut bloquer la région du cerveau d’intérêt et utiliser des forceps fins pour effacer soigneusement la surface dorsale de toute trachée, en prenant soin d’éviter la perturbation du tissu cérébral lui-même. Retirez et rafraîchissez la solution de la Sonnerie au besoin pour dégager la zone des débris tissulaires.
Et placez une aiguille hypodermique de livraison d’odeur approximativement un centimètre de la tête de la mouche, prenant soin qu’il n’y a rien qui pourrait obstruer la livraison d’odeur à l’antenne. Connectez ensuite la chambre d’imagerie au système de livraison d’odeurs par l’intermédiaire de l’aiguille hypodermique de livraison d’odeur. Et permettre à la mouche 10 minutes pour récupérer de l’anesthésie et la chirurgie.
Pour la visualisation des indicateurs calciques basés sur le GFP, accordez le laser d’un microscope multi-photon équipé d’un laser infrarouge et d’un objectif d’immersion d’eau installé sur une table isolée de vibration à une longueur d’onde d’excitation de 920 nanomètres et installez un filtre à bande GFP. À l’aide du bouton d’ajustement Z du cours, numérisez l’axe Z du cerveau pour localiser la région cérébrale d’intérêt. Utilisez la fonction culture pour concentrer la numérisation uniquement sur la zone d’intérêt, afin de minimiser le temps d’analyse.
Et faites pivoter la vue de balayage de telle sorte que l’antérieur de la tête est orienté vers le bas. Ajustez ensuite la taille du cadre à 512 par 512 pixels et sélectionnez la région à numériser. En tenant compte du temps d’analyse calculé pour chaque image, pour atteindre un taux d’image d’au moins quatre hertz.
Pour la visualisation transitoire du calcium évoquée par l’odeur, lancez un macro package préprogrammé capable de relier le logiciel d’acquisition d’images et le programme de livraison d’odeurs et commencez la mesure dans le logiciel microscope pendant 6,25 secondes pour établir une valeur de référence F0. Dans le système de livraison des odeurs, fournir un stimulus d’odeur de 2,5 secondes indiqué ici par l’éclairage des LED déclenchée par l’ouverture et la fermeture de valves coupe odeur spécifique. Suivi de 12,5 secondes d’enregistrement à la fin de la compensation des odeurs.
Répétez ensuite la livraison d’un deuxième et d’un troisième odorant de la même manière. Pour effectuer le conditionnement associatif dans cette configuration, utilisez le système de livraison d’odeurs contrôlée par ordinateur pour présenter l’odeur de stimulus conditionné plus pendant 60 secondes aux côtés de 12 chocs électriques de 90 volts. Après une pause de 60 secondes présenter le stimulus conditionné-moins-odeur seul pendant 60 secondes sans choc électrique.
Mesurer l’odeur post-entraînement évoquait à nouveau l’éphémère du calcium en répétant le protocole de stimulation des odeurs avant l’entraînement trois minutes après la fin de la phase d’entraînement. Enregistrez ensuite les fichiers d’imagerie dans un format approprié pour une analyse d’image ultérieure. Ici, des images représentatives de neurone de sortie de corps de champignon, acquises comme démontré peuvent être observées.
L’expression compartimentée spécifique du capteur dHomer-GCaMP3, qui n’est pas exprimée dans les compartiments axonals du neurone, démontre un signal ponctué dans le compartiment dendritique. Des réponses claires mais inférieures d’odeur d’amplitude peuvent être observées dans les mouches exprimant dHomer-GCaMp3, comparées aux mouches exprimant le GCaMP6f cytosolic. Ici, des traces représentatives de calcium d’une mouche individuelle démontrent des variations dans le niveau de bruit et l’amplitude qui peuvent être obtenues entre les préparations individuelles.
Cette technique a ouvert la possibilité de visualiser au niveau subcellulaire, comment les représentations olfactives sont modulées et comment les phases de mémoire sont formées par conditionnement. De telles expériences seront essentielles pour élargir notre compréhension des structures cérébrales complexes telles que le corps champignon, et pour caractériser la façon dont les souvenirs associatifs sont stockés à travers les populations distribuées de neurones.
