Nous sommes reconnaissants à Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya pour l&#39;assistance lors de la préparation de ce manuscrit; Mariana Wolfner pour des discussions sur l&#39;activation de l&#39;œuf; Matt Wayland pour le support d&#39;imagerie; et Nan Hu pour le soutien général en laboratoire. Ce travail a été soutenu par l&#39;Université de Cambridge, ISSF à TTW [numéro de subvention 097814].

Remarque: Effectuer toutes les étapes à la température ambiante, sauf indication contraire. 1. Préparation de Dissection Remarque: Les étapes décrites ici sont conformes à E. Gavis, Princeton University et Weil et. al. 18. Effectuez les étapes suivantes, deux jours avant l&#39;imagerie. <ol><li> Prenez un flacon de mouche contenant environ 10 ml de nourriture solide et ajouter une petite quantité de levure sèche dans un coin, à moins de 1 g est suffisante. Remarque: Pour des informations sur les flacons de mouches ou de la nourriture voir &#39;Drosophila Maintenance&#39; 19. </li><li> Ajouter 1 - 3 gouttes d&#39;eau pour hydrater la levure. </li><li> Réglez le flacon de côté à un angle de 45 ° et laisser 3-5 min pour la levure de prendre l&#39;eau. </li><li> Bien que la levure absorbe l&#39;eau, sélectionnez une bouteille de mouches exprimant UASt- myr GCaMP5 20 entraînée par un bain-VP16GAL4 (dénommé GCaMP5) qui ont récemment vu le jour (un myristoyforme lated du GCaMP5 a été choisi pour fournir un signal élevé par rapport au bruit par le biais d&#39;attacher la GECI à la membrane dans l&#39;œuf). </li><li> Anesthésier les mouches dans la bouteille avec du gaz CO 2. Soyez sûr de garder la bouteille inversée afin de ne pas perdre de mouches dans la nourriture humide. </li><li> Astuce vol anesthésiés sur un tampon de CO 2 et de trier 10 - 15 femelles et 5 mâles à l&#39; aide d&#39; un pinceau sous un microscope à dissection. Note: Il est standard pour inclure les hommes pour fournir des femelles en bonne santé pour la dissection. </li><li> Lorsque le flacon de l&#39;étape 1.3 est prêt, ajouter les mouches sélectionnées dans le flacon. Prenez soin de garder l&#39;horizontale flacon jusqu&#39;à ce que les mouches deviennent actifs. </li><li> Placer le flacon à 25 ° C pendant environ 36 heures. </li><li> Retour à vol restants du CO 2 pad à la bouteille ou défausse. </li></ol> 2. Dissecting Drosophila Ovaires Note: Les étapes décrites ici sont conformes à Weil et al. Al. <sup&gt; 18. <ol><li> Après 36 h, anesthésier les mouches du flacon yeasted avec du CO 2. </li><li> Une fois que les mouches à l&#39; intérieur du flacon sont anesthésiés leur donner un pourboire sur le CO 2 pad à trier avec une brosse de peinture sous un microscope à dissection. </li><li> Sélectionnez une femelle. </li><li> Isoler les deux ovaires de la femelle. Pour le protocole complet et détaillé voir Weil et. al. 18. En résumé: <ol><li> Placer une petite goutte d&#39;huile d&#39;hydrocarbures halogénés oxygénés (série 95) sur un n ° 1,5, 22 x 40 mm lamelle. </li><li> Attrapez la femelle avec une pince à la partie antérieure de l&#39;abdomen. </li><li> Tenir la femme sous le microscope de dissection, utiliser le second jeu de pinces pour enlever délicatement la partie postérieure de la femelle. </li><li> Essuyez le tissu postérieur de la deuxième pince. </li><li> Presser sur la cavité abdominale avec les secondes pinces de la partie antérieure à la partie postérieure de l&#39;abdomen. Les deux ovaires opaques doivent coller à la pince lorsque l&#39;extérieur de la FEMAle. </li><li> Appuyez sur les ovaires dans l&#39;huile. </li><li> Retirez tout tissu de la pince en essuyant la pince. </li><li> Répétez ces étapes (2.4.1 - 2.4.7) pour obtenir trois lamelles, chacun contenant des ovaires d&#39;une mouche. </li></ol></li></ol> 3. Isolating individuel Oeufs d&#39;âge mûr <ol><li> Sous un microscope à dissection standard avec le grossissement réglé à 4X, sur la première lamelle de l&#39;étape 2.4, séparer les deux ovaires en déchirant l&#39;oviducte. </li><li> Introduire une paire de pinces fermées dans le centre d&#39;un seul ovaire, en prenant soin de ne pas percer des chambres d&#39;œufs. </li><li> Insérer une sonde de dissection standard dans le centre de l&#39;ovaire, à côté de la pince fermée. </li><li> faites glisser doucement la sonde de dissection à travers l&#39;ovaire vers le pôle postérieur, où se trouvent les oeufs matures (stade 14 chambres d&#39;oeufs). </li><li> Répéter les étapes 3.1 - 3.4 2 - 5 fois en fonction de la taille de l&#39;ovaire et du nombre d&#39;oeufs. Note: L&#39; addition de CO 2 </sub&gt; provoque généralement le dépôt d&#39;un seul œuf qui apparaîtra plus grande avec des appendices dorsaux soulevées que les œufs pré-déposés. Cet oeuf doit être mis au rebut pour l&#39;imagerie, car il a déjà été activé à l&#39;intérieur de la femelle. Remarque: les oeufs matures sont susceptibles de se séparer facilement du tissu conjonctif de l&#39;ovaire. </li><li> Si pas d&#39;oeufs matures sont visibles à l&#39;extérieur de l&#39;ovaire, continuez doucement taquiner avec la sonde de dissection. </li><li> Une fois les oeufs matures sont visibles sur la lamelle couvre-objet en dehors de l&#39;ovaire, de manoeuvre 3 - 5 dans une ligne du centre de la lamelle couvre-objet. Note: Pour de meilleurs résultats, exécutez la sonde doucement le long du côté des œufs. Remarque: Évitez de tirer sur les appendices dorsaux car cela peut endommager l&#39;œuf. Remarque: En fonction de l&#39;imagerie future mise en place, aligner les oeufs environ 200 um à part perpendiculairement à la lamelle pour la zone maximale d&#39;imagerie. </li><li> Une fois aligné, retirez le reste du tissu ovarien en le faisant glisser à l&#39;écart des œufs alignés en utilisant le forceps. </li><li> Retirer l&#39;excès d&#39;huile en tamponnant avec le coin d&#39;essuyer un examen médical. Veillez à ne pas toucher les oeufs matures avec le médical lingette oeufs matures qui sont contactés seront perdus. </li><li> Dessiner une croix sur la lamelle couvre-objet avec un marqueur pour faciliter la localisation de l&#39;échantillon sous le microscope. </li><li> Régler la lamelle dans un endroit sûr et de laisser les chambres d&#39;œufs préparés sur la lamelle pour se reposer pendant 5 - 10 min. Ceci permet à l&#39;oeuf se déposer dans l&#39;huile. Les échantillons peuvent être utilisés jusqu&#39;à 1 h après dissection. </li><li> Répétez les étapes 03.01 à 03.11 pour le reste des lamelles avec des ovaires sur eux. </li></ol> 4. Préparation de l&#39;imagerie <ol><li> Amener le tampon d&#39;activation préparé 15 à la température ambiante. Note: Le tampon d&#39;activation est un tampon hypotonique: 3,3 mM , NaH 2 PO 4, 16,6 mM de KH 2 PO 4, NaCl 10 mM, KCl 50 mM, 5% de polyéthylèneglycol 8000, CaCl2 2 mM, porté à pH 6,4 avec un mélange 1: 5 rapport de NaOH: KOH.Pour plus d&#39; informations , voir Mahowald 1983 15. Aliquotes de tampon d&#39;activation peut être stocké à -20 ° C pendant des mois et à 4 ° C pendant 2 semaines. </li><li> transporter soigneusement préparés, des lamelles tampon d&#39;activation et de pipettes en verre vers l&#39;installation d&#39;imagerie. Note: Un grand champ, confocal, disque tournant ou d&#39;une feuille microscope optique peuvent être utilisés. Nous vous recommandons d&#39;utiliser un microscope inversé. Nos résultats représentatifs ont été obtenus en utilisant un microscope confocal. </li><li> Un objectif approprié pour l&#39;imagerie de l&#39;ensemble ovule mature doit être choisi (ici: 20X 0,7 NA). </li><li> Monter la première lamelle préparée à l&#39;étape de microscope. Prenez soin de ne pas briser les lamelles sur la scène. </li><li> sélectionnez Qualitativement un champ de vision avec une chambre d&#39;ovule mature pour l&#39;activation. Ne pas l&#39;image ponctionné chambres d&#39;œufs ou ceux avec bourgeonnement dans la membrane. Remarque: Pour les étapes 4.6 - 4.7, les commandes logicielles varient en fonction de microscope et le fabricant. </li><li> Set para d&#39;imageriemètres pour l&#39;excitation standard GFP (488 nm) et d&#39;émission (500-580 nm). Également mis en place une vue à champ lumineux afin de visualiser et d&#39;orienter l&#39;ovule mature et huile déplacée. </li><li> Sélectionnez le plus bas Z-plan où les oeufs matures sont visibles et définir un Z-pile complète à prendre pour 40 um à environ 2 pm par étape. Réglez les paramètres donc il n&#39;y a pas de délai entre l&#39;acquisition Z-stack. Définir la série de temps pour capturer pendant environ 30 min. </li></ol> 5. Activation de l&#39; imagerie ex vivo d&#39; oeuf <ol><li> Lancer la capture d&#39;image. </li><li> Attendre 1 - 2 Z-piles complètes à acquérir. Ceci montre l&#39;ovule mature avant l&#39;activation. </li><li> Retirer environ 300 ul de tampon d&#39;activation dans une pipette en verre. </li><li> Le positionnement de la pointe de la pipette en verre contenant un tampon d&#39;activation à un angle de 45 ° au-dessus de la lamelle, déplacer lentement la pipette dans la trajectoire du faisceau jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit directement au-dessus de l&#39;œuf mûr imagée. La pipette de verre devraitêtre de 1 - 2 cm au-dessus de l&#39;huile. </li><li> Ajouter 1 - 2 gouttes de tampon d&#39;activation en moins de 5 secondes de la pipette en verre. Cela devrait déplacer l&#39;huile. Évitez d&#39;ajouter un tampon d&#39;activation en excès ou en touchant l&#39;œuf avec la pipette en verre, car il peut provoquer le déplacement de l&#39;ovule mature. Prenez soin de ne pas toucher la lamelle avec la pipette, car cela peut provoquer un changement dans le plan ou bulles d&#39;air focaux pour former dans l&#39;huile d&#39;immersion entre l&#39;objectif et la lamelle. </li><li> Alors que l&#39;ajout d&#39;un tampon d&#39;activation lors de l&#39;acquisition d&#39;image, vérifiez le canal champ lumineux pour veiller à ce que l&#39;huile a été déplacé par le tampon d&#39;activation. Note: Ceci apparaît d&#39;abord comme une ombre due à la pipette briser la trajectoire du faisceau, mais se traduira également par l&#39;apparition de petites gouttelettes d&#39;huile. Quelques gouttes d&#39;huile peuvent rester associé à l&#39;ovule mature qui aura une incidence sur les résultats expérimentaux et la qualité de l&#39;image. </li><li> Si l&#39;huile ne soit pas déplacé à partir de la première addition de répéter les étapes d&#39;activation du tampon de 5,4 à 5.6. </li><li> Lorsque l&#39;huile est déplacée avec succès, permettre à la série temporelle de fonctionner jusqu&#39;à son achèvement. Remarque: En raison de l&#39;enflure des ovocytes à l&#39;activation, certaines chambres d&#39;œufs vont se déplacer de façon spectaculaire sur le plan ou le champ de vision central lors de l&#39;addition de tampon d&#39;activation. Dans cette situation, arrêtez l&#39;acquisition et monter la prochaine lamelle. </li><li> Après la séquence d&#39;images a complété l&#39;acquisition, enregistrer les données. </li></ol> 6. Post-acquisition Traitement d&#39;image <ol><li> Ouvrez le jeu de données à l&#39;aide de Fidji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), ou d&#39;un logiciel équivalent de traitement d&#39;image, et sélectionnez les fichiers pertinents pour l&#39;analyse. </li><li> Pour construire une projection des données acquises sélectionnez: Image&gt; Piles&gt; Z-projet. </li><li> Sélectionnez un début Z-slice et un arrêt Z-slice, généralement toute la section. Sélectionnez un type de projection, généralement réglé sur &#39;Max Intensité. Cochez la case à cocher &quot;All Time Frames &#39;pour appliquer les paramètres sélectionnés pour toute la série. </li><li> Siplus d&#39;un canal fluorescent a été imagé, utilisez l&#39;outil de canaux pour permettre le mouvement entre les couleurs, faire un composite, ou faire de l&#39;image en niveaux de gris. Sélectionnez Image&gt; Couleurs&gt; Canaux outil. </li><li> Pour régler la luminosité de l&#39;image et le contraste sélectionnez Image&gt; Réglages&gt; Luminosité / Contraste. </li><li> Pour exporter une seule image, déplacer curseur calendrier au cadre pertinent et sélectionnez Fichier&gt; Enregistrer sous&gt; Jpeg, ou tout autre format préféré. </li><li> Choisissez un emplacement et le titre pour le fichier exporté, puis enregistrez. Remarque Le taux à partir du logiciel d&#39;imagerie de trame sera nécessaire pour donner un horodatage sur l&#39;image. </li><li> Pour exporter la série chronologique comme un film sélectionnez: Fichier&gt; Enregistrer sous&gt; AVI, puis sélectionnez la cadence (~ 7 images par seconde). </li><li> Choisissez un emplacement et le titre pour le fichier exporté, puis enregistrez. </li><li> Pour enregistrer le fichier ajusté au format Fidji, sélectionnez Fichier&gt; Enregistrer. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable. 
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol. 
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer. 
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization. 
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.

Un changement de Ca 2+ intracellulaire concentration à ovule (ovocyte) activation est un élément conservé de tous les organismes étudiés 1,2. Cet événement déclenche un large éventail de processus -dépendantes de Ca, y compris la reprise du cycle cellulaire et la traduction des ARNm stockées. En raison de cette exigence pour Ca 2+, de visualiser les changements transitoires de Ca2 + intracellulaire des concentrations a été d&#39; un intérêt primordial. Historiquement, les organismes modèles ont été choisis pour des études sur l&#39;activation des oeufs en fonction de la taille et de la disponibilité de leurs oeufs. Diverses approches de visualisation ont été utilisées pour suivre et quantifier les changements intracellulaire de Ca2 + concentrations dans ces systèmes, y compris: la photoprotéine aequorine en medaka poissons 3; Ca 2+ colorants fluorescents sensibles tels que Fura-2 dans oursin et le hamster 4,5; et de calcium vert-1-dextran dans Xenopus 6. La génération et l&#39; amélioration des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECIS) a transformé la capacité de visualiser Ca 2+ dynamique in vivo 7. Ces constructions génétiques sont exprimés dans des tissus spécifiques et de limiter le besoin de préparations tissulaires invasives 8. GCaMPs sont une protéine fluorescente verte (GFP) classe à base de GECIS qui ont été très efficaces en raison de leur forte affinité Ca 2+, le rapport et la capacité signal-bruit pour être personnalisés 9-11. En présence de Ca 2+, le complexe GCaMP subit une série de changements conformationnels, en commençant par la liaison de Ca2 + à la calmoduline qui se traduit par une augmentation de l&#39; intensité de fluorescence de la composante de GFP 9. GCaMPs ont été largement utilisés dans la recherche sur les neurones de Drosophila pour visualiser les changements de calcium intracellulaire 12. Les applicati récentssur la technologie GCaMP pour visualiser Ca 2+ dans les œufs de Drosophila matures a révélé un seul transitoire Ca 2+ onde à l&#39; activation de l&#39; œuf 13,14. La vague Ca 2+ peut être visualisé à faible grossissement pendant l&#39; ovulation in vivo 13 ou à un grossissement plus élevé en utilisant un essai ex vivo d&#39;activation 13,14. Dans le dosage ex vivo, les ovocytes matures individuels sont isolés des ovaires et activés à l&#39; aide d&#39; une solution hypotonique, dénommé tampon d&#39;activation, ce qui a été montré pour récapituler les événements d&#39;activation in vivo 15-17. Ce test ex vivo permet facilement de haute résolution visualisation de la Ca 2+ onde dans différentes conditions expérimentales , y compris la perturbation pharmacologique, les manipulations physiques et mutants génétiques. Cet article montre la préparation d&#39;œufs de Drosophila matures pour ex vivo et activation ee microscopie ultérieure utilisée pour visualiser l&#39;onde Ca 2+ en utilisant GCaMP. Cette approche peut être utilisée pour tester l&#39;initiation et le contrôle de l&#39;onde Ca 2+ et de sonder les résultats en aval.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="999">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry active yeast</td>
			<td style="width:373px;">Fleischman&#8217;s</td>
			<td style="width:243px;">#2192</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lamp</td>
			<td>Mircotec Fibre optic</td>
			<td>MF0-90</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Medical wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Corporation</td>
			<td>KLEW3020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Marker pen</td>
			<td>Stabilo</td>
			<td>841/46</td>
			<td>OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 pad</td>
			<td>&#160;Genesee Scientific</td>
			<td>59-114 (789060 Dutscher)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slip No. 1.5, 22 x 50mm</td>
			<td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td>
			<td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;">Halocarbon oil, series 95</td>
			<td rowspan="2">Halocarbon Products Corp.</td>
			<td>Distributor in Europe:</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Solvadis (GMBH)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oil 10 S</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td align="right">24627.188</td>
			<td>Can be used instead of Halocarbon oil, series 95</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10140-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass pipette</td>
			<td>Fisherbrand,</td>
			<td>FB50251</td>
			<td>Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150mm length&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vial</td>
			<td style="width:373px;">Regina Industries</td>
			<td style="width:243px;">P1014</td>
			<td>GPPS&#160; 80mm x 25mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging calcium in drosophila at egg activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Ici , nous avons démontré comment préparer des œufs de Drosophila matures ex vivo activation. Les œufs exprimant un GECI permettre l&#39; imagerie de Ca2 + dynamique lors de l&#39; activation de l&#39; œuf et le début du développement de l&#39; embryon (figure 1). Il convient de noter que , selon le GCaMP utilisé, en particulier la présence d&#39;un groupe myristoyle, les résultats peuvent présenter de légères différences qualitatives 13 14. Nous avons également démontré un rôle pour l&#39; actine fonctionnelle lors de l&#39; activation de l&#39; œuf par l&#39;addition d&#39;un inhibiteur de polymérisation de l&#39; actine, la cytochalasine D, le tampon d&#39;activation (figure 2) 14. Une exigence pour le cytosquelette lors de l&#39;activation de l&#39;œuf est conservée. En C. elegans, après la fécondation, les composants du cytosquelette sont réorganisés pour préparer l&#39;embryon d&#39; une cellule pour la première division asymétrique 21,22. En oursin de mer, la perturbation des cytoskeletal réorganisation suite à l&#39; activation a été montré pour affecter le cycle cellulaire en empêchant contractile formation de l&#39; anneau 23. Le rôle de l&#39; actine dans la médiation d&#39; une vague Ca 2+ et sa fonction aval lors de l&#39; activation de l&#39; œuf chez la drosophile reste à élucider. Chez la drosophile, la co-visualisation de l&#39;onde et le cytosquelette d&#39; actine Ca2 + peut être réalisé en utilisant ce dosage ex vivo d&#39;activation. Les séries chronologiques de multiples canaux peut être acquis et la dynamique du Ca2 * intracellulaire peut être associé à des changements dans l&#39; organisation de l&#39; actine dans l&#39;ovocyte (Figure 3). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> Figure 1:. A Single Ca 2+ vagues à la série Drosophila Egg Activation Temps des ex vivo matures Drosophila exprimant oeuf UASt- myrGCaMP5 suivant l&#39;uneddition de tampon d&#39;activation (AH). L&#39;augmentation du Ca 2+ cytoplasmique commençant au niveau du pôle postérieur (B) et se propage (BF) avec une vitesse moyenne d&#39;environ 1,5 um / s. L&#39;initiation de l&#39;onde est typiquement observée dans les 3 minutes de l&#39;addition d&#39;un tampon d&#39;activation. Après activation, les taux de calcium intracellulaire de l&#39;ovule mature retourne à des niveaux (G, H) d&#39;activation pré. Voir un film supplémentaire 1 (durée totale de 33 min). Barres d&#39;échelle = 50 pm. Projection Max = 40 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> Figure 2: Ajout de cytochalasine D Activation Buffer perturbe Ca2+ propagation des ondes. Série Temps d&#39;ex vivo matures Drosophila exprimant oeuf UASt- myrGCaMP5 après addition de tampon d&#39;activation contenant 10 pg / ml de cytochalasine D concentration finale (AH). Tandis que le Ca2 + onde est initiée au niveau du pôle postérieur (A), elle est compromise et ne parvient pas à la partie antérieure de l&#39;œuf (F) (pointes de flèches blanches indiquent la face de la vague). Pas encore les changements de Ca ont été observés plus de 30 min). Voir un film supplémentaire 2 (durée totale de 30 min). Barres d&#39;échelle = 50 pm. Projection Max = 40 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> Figure 3: Co-visualisation de l&#39; actine et de Ca 2+ à EActivation de gg en série Drosophila. Temps d&#39;ex vivo matures Drosophila oeuf exprimant UASt- myrGCaMP5 (Cyan) et UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) après addition de tampon d&#39;activation (AH). Le Ca 2+ vague amorce du pôle postérieur et récupère comme dans la figure 1. Actine semble changer au fil du temps, des pointes de flèches blanches (A vs H). L&#39;absence de détection de signal de Ca dans le centre de l&#39;ovule mature est due au déplacement de l&#39;échantillon lors de la capture d&#39; image. Barres d&#39;échelle = 50 pm. Projection Max = 40 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Cet article décrit un protocole ex vivo adaptable pour la visualisation de Ca 2+ lors de l&#39; activation de l&#39; œuf chez la drosophile.

Imagerie de calcium dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Activation à Egg

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

imaging-calcium-in-drosophila-at-egg-activation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

7.8K vues.  University of Cambridge.  Cet article décrit un protocole ex vivo adaptable pour la visualisation de Ca 2+ lors de l' activation de l' œuf chez la drosophile. 

Vidéo: Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-imagerie de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Nymphe yeux

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Recherche

Biologie du développement

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Imagerie Montant du<em&gt; Drosophila</em&gt; Chambres d&#39;oeufs

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Imaging Effacé embryonnaire et postnatal coeurs à la résolution unicellulaire

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

Méthodes pour examiner la lymphe et Gland hémocytes dans<em&gt; Drosophila</em&gt; larves

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

À long terme d&#39;imagerie en direct de<em&gt; drosophile</em&gt; Disc Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

In Vivo Imagerie de la morphogénèse du Muscle-tendon en pupes de drosophile

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

Analyse de la dynamique de l'actomyosine à l'échelle locale cellulaire et tissulaire à l'aide de films time-lapse de chambres d'oeufs drosophila cultivées

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Imagerie et analyse en direct des contractions musculaires dans l'embryon de Drosophila

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Dégel, cultivant et cryoconservation des lignées de cellules de drosophile

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Imagerie de calcium fluorescent et hybridation in situ subséquente pour la caractérisation neuronale de précurseur dans Les laevis de Xenopus

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...