Ce protocole décrit trois analyses in vitro qui évaluent collectivement les fonctions des cellules endothéliales périventriculaires humaines et leur interaction avec les interneurones GABAergic humains. Les résultats de ces analyses fourniront un aperçu critique du lien entre les cellules endothéliales périventriculaires et les troubles cérébraux. Ces analyses sont simples, peu coûteux et permettent de mesurer la migration cellulaire de l’aire de répartition des centimètres, ce qui n’est pas réalisé par d’autres analyses existantes.
Les défauts de migration et de distribution des interneurones gabaergiques sont associés à des troubles psychiatriques, tels que l’autisme, l’épilepsie, la schizophrénie et la dépression. Par conséquent, il est essentiel d’étudier l’interaction des cellules endothéliales périventriculaires avec les interneurones GABAergic dans le contexte humain pour adresser la pathogénie de ces désordres. Commencez par préparer les cellules humaines pour l’analyse.
Permettre aux cellules endothéliales périventriculaires humaines d’atteindre 70 à 80% de confluence puis de les dissocier selon les directives du manuscrit et de les compter à l’aide de la méthode d’exclusion bleue trypan. Pour préparer les interneurones GABAergiques humains, la solution de dissociation cellulaire chaude et un aliquot de milieu neuronal à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, aspirez le milieu de chaque puits contenant des cellules et lavez-les avec un millimètre de PBS par puits.
Détachez les cellules en ajoutant 0,5 millilitres de solution de dissociation préchaurée par puits et en les incubant à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’incubation, ajouter un millilitre de milieu neuronal par puits et transférer la solution cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres, triturant doucement pour dissocier les touffes cellulaires. Centrifuger les cellules à 380 fois G pendant cinq minutes à température ambiante, aspirer le supernatant et resuspendre la pastille cellulaire en un millilitre de milieu neuronal.
Comptez ensuite les cellules vivantes à l’aide de l’exclusion bleue trypan. Préparer le contrôle des cellules endothéliales humaines en réchauffant la solution de dissociation cellulaire et un aliquot de milieu endothélial à 37 degrés Celsius, 10 minutes avant utilisation. Aspirer le milieu de chaque puits et les laver avec un millilitre de PBS par puits.
Détachez les cellules en ajoutant 0,5 millilitres de la solution de dissociation préchauffée à chaque puits et en incubant la plaque à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu cellulaire endothélial par puits pour neutraliser la solution de dissociation et transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger les cellules à 200 fois G pendant cinq minutes, aspirer le supernatant et resuspendre les cellules en un millilitre de milieu cellulaire endothélial.
Ensuite, utilisez la méthode d’exclusion trypan pour compter les cellules. Préparez un insert de culture de puits en coupant trois côtés d’un puits d’un insert de culture de deux puits de silicone avec une lame stérile. Retirez l’insert avec des pinces stériles et placez-le au centre d’un plat en poly-L-ornithine et enrobé de laminine, puis pressez le long du bord de l’insert pour le fixer à la surface.
Retournez soigneusement le plat à l’envers pour vérifier que l’insert est fermement adhéré, et marquez la limite du compartiment d’insertion à l’aide d’un marché noir permanent avec une pointe ultra fine. Suspendre les interneurones GABAergiques humains dans les cellules endothéliales périventriculaires moyennes et humaines neuronales et les cellules endothéliales moyennes à une concentration de 30 000 pour 70 microlitres, puis ensemencer 70 microlitres de la solution cellulaire à l’intérieur de chaque insert de culture de puits. Ajouter un millilitre de milieu neuronal au plat de neurones pour remplir la zone autour de l’insert et empêcher le revêtement de sécher.
De même, ajouter un millilitre de milieu cellulaire endothélial au plat périventriculaire des cellules endothéliales. Vérifiez les cellules au microscope pour vérifier qu’elles ne fuient pas du compartiment d’insertion, puis incubez-les à 37 degrés Celsius et à 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Après l’incubation, vérifiez à nouveau les cellules au microscope pour vérifier qu’elles sont bien attachées.
48 heures après l’ensemencement, retirer délicatement l’insert à l’aide d’une pince stérile et vérifier les cellules au microscope pour vérifier que la couche cellulaire reste intacte. Retirez le milieu du neurone et des plats périventriculaires des cellules endothéliales, et ajoutez un millilitre de milieu frais à chaque plat. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant cinq jours.
Ensuite, retirez le milieu, fixez les cellules avec 4%PFA pendant 10 minutes et lavez-les trois fois avec PBS. Pour effectuer l’analyse de co-culture, suspendre 30 000 interneurones gabaergiques et 30 000 cellules endothéliales périventriculaires humaines dans 70 microlitres de milieu de co-culture, puis ensemencer cette solution cellulaire à l’intérieur d’un compartiment d’insertion d’un puits. Après 48 heures, retirer l’insert.
Incuber la co-culture à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant cinq jours. Après l’incubation, retirer le milieu, fixer les cellules avec 4%PFA et les laver trois fois avec PBS. Pour effectuer l’analyse de chimio-attraction, placez un insert de culture de trois puits au centre d’un plat poly-L-ornithine et laminin-enduit de 35 millimètres, tournez le plat à l’envers, et marquez la frontière autour du compartiment central de l’insert à l’aide d’un marqueur permanent avec une pointe ultra fine.
Graine 30 000 interurons GABAergic dans 70 microlitres de milieu neuronal dans le compartiment central, puis graine 10 000 cellules endothéliales périventriculaires et 10 000 cellules endothéliales de contrôle et 70 microlitres de leur milieu respectif dans les deux compartiments extérieurs. Ajouter un millilitre de milieu de co-culture le long du côté du plat pour empêcher le revêtement sur le plat de sécher. Après 48 heures, retirer l’insert et incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 36 heures.
Après l’incubation, retirer le milieu, fixer les cellules et les laver trois fois avec PBS. Des analyses de migration à longue distance et de co-culture ont été utilisées pour étudier les interactions entre les cellules endothéliales périventriculaires et les neurones GABAergic. Dans l’analyse de migration à longue distance, les cellules ont commencé comme un patch rectangulaire le jour zéro, mais par 48 heures, ils avaient migré dans l’espace sans cellules.
La coloration immunocytochimique avec l’anticorps anti-actif Caspase-3, un marqueur de l’apoptose, n’a montré aucun signal apoptotique dans les neurones ensemencés. Dans l’analyse de la migration de co-culture, lorsque les interneurones étaient co-ensemencés avec des cellules endothéliales périventriculaires humaines, les neurones parcouraient des distances plus éloignées que lorsque les interurônes étaient ensemencés seuls ou lorsqu’ils étaient cosemencés avec des cellules endothéliales de contrôle. Dans l’analyse de chimio-attraction, un nombre sensiblement plus élevé d’interneurones ont migré vers les cellules endothéliales périventriculaires comparées aux cellules endothéliales de contrôle, confirmant que les interneurones GABAergic répondent sélectivement aux indices chemo-attrayants sécrétés par les cellules endothéliales périventriculaires.
Ces analyses peuvent être modifiées à l’aide de ligands, inhibiteurs ou arenes d’essai pour obtenir des aperçus mécanistes sur les interactions des cellules endothéliales périventriculaires humaines avec les interneurones humains. Ils peuvent également être employés pour étudier l’interaction des cellules endothéliales périventriculaires humaines avec d’autres cellules neurales comme rapporté par notre groupe et d’autres. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de fixer fermement l’insert sur le plat et de le garder intact tout au long de l’analyse, sinon il peut conduire à une fuite cellulaire, le détachement cellulaire ou le désalignement de l’insert avec la limite tracée.
Nos travaux ont indiqué le rôle autonome cellulaire des cellules endothéliales périventriculaires humaines dans la pathogénie des désordres psychiatriques comme la schizophrénie, l’épilepsie et l’autisme. Ces analyses permettront donc d’évaluer les cellules endothéliales périventriculaires malades dérivées de patients atteints de ces troubles à l’aide de la technologie IPSC.
