Le dysfonctionnement mitochondrial sous-tend beaucoup de maladies neurodegenerative. Notre protocole fournit un outil important pour examiner la dynamique mitochondrique dans les axones, facilitant l’étude des maladies neurologiques impliquant la dégénérescence axonale. En combinant l’étiquetage mitochondrial, l’imagerie cellulaire vivante et la technologie induite des cellules souches pluripotentes, notre protocole peut être utilisé pour caractériser le trafic mitochondrial le long des axones humains et analyser leurs morphologies.
Le transport et la morphologie mitochondriques altérés peuvent être observés dans les cultures de cellules souches et les modèles animaux des maladies neurodégénératives fournissant des cibles thérapeutiques potentielles pour traiter ces maladies. Après le jour trente-cinq de la culture, dissocier les neurosphères différenciées des cellules souches pluripotentes induites par l’homme en petits groupes avec 1 mg/ml de solution de détachement cellulaire pendant deux minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation recueillir les grappes cellulaires par centrifugation et de résuspendre la pastille en un millilitre de NDM.
Plaque environ cinq grappes de cellules dans une centaine de microlitres de milieu par polyornithine et de déshydrogénase de lactose élevant sans virus réduit facteur de croissance membrane membrane enrobée de 35 millimètres de fond en verre plats. Ajoutez ensuite un millilitre de NDM complété par B27, monophosphate cyclique d’adénosine, facteur de croissance insuline-comme, facteur neurotrophique cerveau-dérivé humain et facteur neurotrophique glial cellule-dérivé à chaque culture. Pour visualiser les mitochondries le long des axones des neurones du cerveau antérieur d’abord tacher les neurones avec 50 nanomolaires rouge colorant fluorescent dans NDM pendant trois minutes à 37 degrés Celsius suivie de deux lavages dans le NDM chaud.
Ensuite, placez la culture sur la scène d’un microscope à fluorescence et sélectionnez l’objectif 40X. Dans le champ de phase identifier les axones en fonction de leurs caractéristiques morphologiques. Pour distinguer la direction du mouvement mitochondrial le long des axones clairement identifier les corps cellulaires des neurones.
Après avoir distingué le corps cellulaire et l’axon ajuster le temps d’exposition et la mise au point des mitochondries dans les axones et capturer le transport mitochondrial dans les axones toutes les cinq secondes pour un total de cinq minutes. Pour analyser le transport mitochondrial dans ImageJ ouvrir Fidji et sélectionner le plugin Bio-Formats. Utilisez l’importateur Bio-Formats pour importer les images en accéléré de la série tiff et sélectionner imageJ standard et ouvrir toutes les séries.
Vérifiez les canaux fractionnement à l’échelle automatique et cliquez sur OK en prenant soin de noter le numéro d’image et la taille des images en pixels. Après avoir ajusté la luminosité et le contraste pour les 60 images utilisent la ligne segmentée pour tracer une ligne du corps cellulaire à l’axon terminal. Pour générer le Kymograph sélectionnez le plugin Kymograph multiple et sélectionnez la largeur de la ligne.
Pour mesurer la distance, les valeurs de temps et la vitesse pour les mitochondries mobiles ouvertes tsp050607. txt dans le plugin macros. Et tracer une ligne segmentée sur la trace du mouvement mitochondrial sur le kymograph du supérieur à la région inférieure.
Après avoir dessiné la ligne ouverte lire les vitesses à partir de c. à thé dans le plugin macros pour lire les vitesses segmentées correspondant à la ligne. Ensuite, ouvrez l’image d’origine et utilisez l’outil de ligne pour tracer une ligne le long de la barre d’échelle. Sélectionnez analyser pour mesurer la longueur de la ligne et convertir le dx maintenant et les unités de distance des pixels en micromètres.
Ensuite, changez l’heure du pixel en quelques secondes. Pour analyser la longueur et la zone mitochondriales dans les axones d’ImageJ, installez le plugin JAR point de soulignement redressé et ouvrez l’image axon d’intérêt. Convertissez l’image 32 bits en huit bits et utilisez l’outil de ligne segmenté pour tracer l’axon.
Sélectionnez le plugin Jar de soulignement Straighten et réglez la largeur de la ligne large du filament à 50 pixels. Tracez à nouveau l’axon pour générer un axon redressé et ajuster le seuil d’image. Sélectionnez analyser les mesures définies périmètre ajustement ellipse et descripteurs de forme pour définir la mesure et utiliser la fonction de ligne pour mesurer la barre d’échelle dans l’image originale comme démontré.
Sous analyser et définir l’échelle entrer dans la distance en pixels distance connue et l’unité de longueur pour définir l’échelle. Sélectionnez ensuite global pour définir le réglage de l’échelle sur toutes les images. Sélectionnez enfin analyser et analyser les particules pour déterminer la zone et sélectionner les résultats d’affichage pour afficher la mesure qui en résulte.
Après différenciation en neurones glutamatergiques télencéphales, les cellules peuvent être caractérisées par leur expression marqueur T-B-R un et bêta trois tubulines. La coloration avec colorant fluorescent rouge et la formation image de time-lapse permettent l’évaluation du transport axonal des mitochondries. Une seule mitochondrion peut rester statique ou se déplacer dans une direction antérograde ou rétrograde dans un axon.
La vitesse du mouvement mitochondrial le long de l’axon peut être quantifiée comme illustré. Par exemple, à l’aide d’un logiciel d’analyse disponible dans le commerce, le pourcentage de mitochondries motiles est considérablement réduit chez les neurones S-P-G-3-A par rapport aux neurones de type sauvage. Pour analyser la longueur de la zone mitochondriale et le rapport d’aspect, les axones peuvent se redresser dans le logiciel d’analyse d’image et les sélectionner en ajustant le seuil.
La largeur de longueur du périmètre de la zone mitochondriale et le rapport d’aspect peuvent ensuite être obtenus à partir de l’axon redressé. Par exemple, la longueur mitochondrique et le rapport d’aspect sont significativement réduits dans les axones neuronaux S-P-G 15 par rapport aux axones de type sauvage. Il est important de réchauffer le milieu et l’incubateur de microscope pour laver les cellules doucement et pour permettre aux cellules de se stabiliser pendant vingt minutes avant l’imagerie.
Après l’imagerie cellulaire vivante, les cultures peuvent être fixées et soumises à l’immunostaining pour examiner l’expression d’autres protéines d’intérêt. Il est difficile d’examiner la dynamique mitochondrique dans les nerfs humains vivants. Cette technique fournit l’outil unique pour l’étude de la dynamique mitochondrique et de la dégénérescence nerveuse dans la maladie neurologique.
