Les dispositifs microfluidiques compartimentés permettent d’étudier les neurones sous leur forme hautement polarisée. Ces dispositifs jouent un rôle déterminant dans la recherche fondamentale et translationnelle en neurosciences. Ce protocole décrit comment utiliser les puces cycliques de copolymère d’oléfin pour compartimenter les neurones différenciés des cellules souches humaines.
Ces puces COC produisent des cultures plus saines de neurones différenciés par rapport aux appareils multi compartiments PDMS. Dans ce protocole, nous démontrons la culture des neurones différenciés de la lignée de cellules souches H9 approuvée par les NIH. Des procédures similaires peuvent être utilisées pour différencier les neurones des MIPSCs.
Les copeaux multi-compartiments doivent être placés dans un confinement secondaire avec une humidification supplémentaire. Les canaux des puces multi-compartiments doivent être remplis d’une solution pré-couche, puis rincés avec du PBS. Pour commencer, dissoudre la poly-L-ornithine dans l’eau distillée de qualité culture cellulaire pour faire 600 microlitres de solution par puce.
Aspirez le PBS restant des puits, en s’assurant que la pointe pipette est loin de l’ouverture du canal. Chargez 150 microlitres de solution de travail poly-L-ornithine en haut à droite bien. Attendez 90 secondes et ajoutez 150 microlitres de la solution en bas à droite bien.
Attendez cinq minutes et répétez le processus de chargement avec la solution pour les puits gauches. Ensuite, placez le plateau humidificateur avec la puce à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Si vous utilisez une boîte de Pétri, enveloppez-la avec du parafilm et placez-la à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Ensuite, aspirez la solution des puits, en veillant à ce que la pointe pipette soit placée loin de l’ouverture du canal. Et répétez le chargement des puits de droite et de gauche avec 150 microlitres chacun d’eau stérile deux fois. Préparez la solution de travail laminine.
Chargez les puits de droite et de gauche avec 150 microlitres chacun de la solution de travail de laminine. Incuber la puce dans le plateau pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Rincer la puce avec du PBS sans calcium et magnésium.
Chargez les puits de droite et de gauche avec 150 microlitres chacun de PBS. Attends cinq minutes. Aspirez le PBS des puits et rincez la puce avec des supports NSC.
Chargez les puits de droite et de gauche avec 150 microlitres chacun des supports de la CSN. Incuber la puce dans le plateau pendant la nuit dans l’incubateur de 37 degrés Celsius avec 5% de CO2 pour pré-conditionner la puce. Pour ensemencer les cellules souches neurales humaines dans la puce multi-compartiment, comptez d’abord la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre.
Ensuite, aspirez les médias des puits. Pipette cinq microlitres de la solution cellulaire en haut à droite bien, suivie de cinq microlitres en bas à droite bien. Utilisez un microscope pour vérifier que les cellules sont entrées dans le canal.
Attendez cinq minutes que les cellules adhèrent au fond de la puce. Pipette environ 150 microlitres des médias de la CSN aux puits de droite et de gauche. Incuber à 5% de CO2, 37 degrés Celsius dans un récipient humidifié approprié.
Après 48 heures, aspirez les supports NSC des puits et remplacez-les par des supports de différenciation neuronale en ajoutant 150 microlitres à chaque puits supérieur et à chaque puits inférieur. Neurones de culture dans un incubateur de 5%CO2, 37 degrés Celsius dans un plateau humidificateur. Retirez le reste du média de différenciation neuronale du compartiment axonal et placez-le dans un tube de centrifugeuse.
Conserver à 37 degrés Celsius. Mélangez 50 microlitres de la solution virale avec 150 microlitres des supports réchauffés. Pipette 100 microlitres du mélange aux deux puits du compartiment axon.
Incuber pendant deux heures dans un incubateur de 37 degrés Celsius. Retirer et éliminer les médias contenant des virus. Pipette doucement 75 microlitres du média frais à un compartiment d’axon bien et laisser le flux de médias à travers le canal dans d’autres puits d’axon.
Répétez ce processus une fois. Enfin, remplissez le compartiment axon avec les supports enregistrés et transférez la puce à l’incubateur. Après une semaine dans la puce avec le média de différenciation, les cellules souches neurales humaines se sont différenciées en neurones, attachées et réparties uniformément dans le compartiment somatique.
En comparaison, les neurones des appareils PDMS se sont regroupés dès cinq jours après l’ajout de supports de différenciation, ce qui a compromis la santé des cellules. La visualisation des neurones étiquetés et des épines dendritiques avec la protéine fluorescente mCherry a montré que les neurones dérivés du NSC différenciés dans les puces forment des synapses matures. Les neurones ont été étiquetés pour le marqueur synaptique excitateur, vGlut1.
Les résultats d’immunostaining montrent que les neurones viralement étiquetés pourraient co-localisés avec vGlut1, et marqueur neuronal spécifique, Beta-tubulin trois. Les neurones mCherry traduits viralement étendent les projections dans un microenvironnement localisé à l’axone établi dans la puce préassemblée. Une comparaison entre les images des neurones étiquetés mCherry avant et immédiatement après l’axotomie a montré des axones complètement sectionnés.
Il est essentiel de s’assurer que les canaux restent remplis de liquide, sauf lors de l’exécution de la procédure d’axotomie. Les puces compartimentées au COC sont faciles à utiliser et peuvent ouvrir la porte à de nombreuses études liées aux lésions neuronales, à la synaptogenèse, à la plasticité synaptique et à la pathophysiologie de la maladie.
