Nous tenons à souligner le soutien financier de la MRC du Royaume-Uni (G0800498). Nous tenons également à remercier le Professeur JM Fritschy, Université de Zurich, pour fournir l&#39;anticorps GABA A -R spécifique sous-unité γ2 et professeur R. Harvey, UCL Faculté de Pharmacie, pour fournir le pcDNA 3.1 (+) des vecteurs d&#39;expression contenant la résistance aux antibiotiques des gènes pour la production de lignées de cellules HEK293 transfectées de manière stable.

<ol>
	<li>Wang, D. D., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+role+of+GABA+in+cortical+development.">Defining the role of GABA in cortical development.</a> J Physiol. 587, 1873-1879 (2009).</li><li>Ben-Ari, Y., Khalilov, I., Kahle, K. T., Cherubini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GABA+excitatory/inhibitory+shift+in+brain+maturation+and+neurological+disorders.">The GABA excitatory/inhibitory shift in brain maturation and neurological disorders.</a> The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 18, 467-486 (2012).</li><li>Structure Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pharmacology,+and+function+of+GABAA+receptor+subtypes.">pharmacology, and function of GABAA receptor subtypes.</a> Adv Pharmacol. 54, 231-263 (2006).</li><li>Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+action:+opening+of+ligand-gated+ion+channels.">Neurotransmitter action: opening of ligand-gated ion channels.</a> Cell. 72, 31-41 (1993).</li><li>Homanics, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+devoid+of+gamma-aminobutyrate+type+A+receptor+beta3+subunit+have+epilepsy,+cleft+palate,+and+hypersensitive+behavior.">Mice devoid of gamma-aminobutyrate type A receptor beta3 subunit have epilepsy, cleft palate, and hypersensitive behavior.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4143-4148 (1997).</li><li>Gunther, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzodiazepine-insensitive+mice+generated+by+targeted+disruption+of+the+gamma+2+subunit+gene+of+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors.">Benzodiazepine-insensitive mice generated by targeted disruption of the gamma 2 subunit gene of gamma-aminobutyric acid type A receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7749-7753 (1995).</li><li>Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA(A)+receptor+diversity+and+pharmacology.">GABA(A) receptor diversity and pharmacology.</a> Cell Tissue Res. 326, 505-516 (2006).</li><li>Low, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+neuronal+substrate+for+the+selective+attenuation+of+anxiety.">Molecular and neuronal substrate for the selective attenuation of anxiety.</a> Science. 290, 131-134 (2000).</li><li>Rudolph, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzodiazepine+actions+mediated+by+specific+gamma-aminobutyric+acid(A)+receptor+subtypes.">Benzodiazepine actions mediated by specific gamma-aminobutyric acid(A) receptor subtypes.</a> Nature. 401, 796-800 (1999).</li><li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+classical+benzodiazepines:+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes.">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 685-697 (2011).</li><li>Hulst, C., Atack, J. R., Kooy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexity+of+the+GABAA+receptor+shapes+unique+pharmacological+profiles.">The complexity of the GABAA receptor shapes unique pharmacological profiles.</a> Drug Discov Today. 14, 866-875 (2009).</li><li>Essrich, C., Lorez, M., Benson, J. A., Fritschy, J. M., Luscher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+clustering+of+major+GABAA+receptor+subtypes+requires+the+gamma+2+subunit+and+gephyrin.">Postsynaptic clustering of major GABAA receptor subtypes requires the gamma 2 subunit and gephyrin.</a> Nat Neurosci. 1, 563-571 (1998).</li><li>Schweizer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gamma+2+subunit+of+GABA(A)+receptors+is+required+for+maintenance+of+receptors+at+mature+synapses.">The gamma 2 subunit of GABA(A) receptors is required for maintenance of receptors at mature synapses.</a> Mol Cell Neurosci. 24, 442-450 (2003).</li><li>Belelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+GABAA+receptors:+form,+pharmacology,+and+function.">Extrasynaptic GABAA receptors: form, pharmacology, and function.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12757-12763 (2009).</li><li>Connolly, C. N., Wooltorton, J. R., Smart, T. G., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors+is+determined+by+receptor+beta+subunits.">Subcellular localization of gamma-aminobutyric acid type A receptors is determined by receptor beta subunits.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 9899-9904 (1996).</li><li>Connolly, C. N., Krishek, B. J., McDonald, B. J., Smart, T. G., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+cell+surface+expression+of+heteromeric+and+homomeric+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors.">Assembly and cell surface expression of heteromeric and homomeric gamma-aminobutyric acid type A receptors.</a> J Biol Chem. 271, 89-96 (1996).</li><li>Klausberger, T., Roberts, J. D., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-+and+input-specific+differences+in+the+number+and+subtypes+of+synaptic+GABA(A)+receptors+in+the+hippocampus.">Cell type- and input-specific differences in the number and subtypes of synaptic GABA(A) receptors in the hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2513-2521 (2002).</li><li>Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+synapse-specific+clustering+of+GABA(A)+receptors.">Mechanisms underlying synapse-specific clustering of GABA(A) receptors.</a> Eur J Neurosci. 31, 2193-2203 (2010).</li><li>Fritschy, J. M., Panzanelli, P., Tyagarajan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+heterogeneity+of+GABAergic+synapses.">Molecular and functional heterogeneity of GABAergic synapses.</a> Cell Mol Life Sci. 69, 2485-2499 (2012).</li><li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+alpha+5+subunit-containing+GABAA+receptors+mediate+IPSPs+elicited+by+dendrite-preferring+cells+in+rat+neocortex.">Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex.</a> Cereb Cortex. 18, 1260-1271 (2008).</li><li>Thomson, A. M., Bannister, A. P., Hughes, D. I., Pawelzik, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+sensitivity+to+Zolpidem+of+IPSPs+activated+by+morphologically+identified+CA1+interneurons+in+slices+of+rat+hippocampus.">Differential sensitivity to Zolpidem of IPSPs activated by morphologically identified CA1 interneurons in slices of rat hippocampus.</a> Eur J Neurosci. 12, 425-436 (2000).</li><li>Nyiri, G., Freund, T. F., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input-dependent+synaptic+targeting+of+alpha(2)-subunit-containing+GABA(A)+receptors+in+synapses+of+hippocampal+pyramidal+cells+of+the+rat.">Input-dependent synaptic targeting of alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal pyramidal cells of the rat.</a> Eur J Neurosci. 13, 428-442 (2001).</li><li>Treutlein, B., Gokce, O., Quake, S. R., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartography+of+neurexin+alternative+splicing+mapped+by+single-molecule+long-read+mRNA+sequencing.">Cartography of neurexin alternative splicing mapped by single-molecule long-read mRNA sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1291-1299 (2014).</li><li>Siddiqui, T. J., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+organizing+complexes.">Synaptic organizing complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 21, 132-143 (2011).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-order+architecture+of+cell+adhesion+mediated+by+polymorphic+synaptic+adhesion+molecules+neurexin+and+neuroligin.">Higher-order architecture of cell adhesion mediated by polymorphic synaptic adhesion molecules neurexin and neuroligin.</a> Cell reports. 2, 101-110 (2012).</li><li>Krueger, D. D., Tuffy, L. P., Papadopoulos, T., Brose, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neurexins+and+neuroligins+in+the+formation,+maturation,+and+function+of+vertebrate+synapses.">The role of neurexins and neuroligins in the formation, maturation, and function of vertebrate synapses.</a> Current opinion in neurobiology. 22, 412-422 (2012).</li><li>Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin+expressed+in+nonneuronal+cells+triggers+presynaptic+development+in+contacting+axons.">Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons.</a> Cell. 101, 657-669 (2000).</li><li>Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Linhoff, M. W., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexins+induce+differentiation+of+GABA+and+glutamate+postsynaptic+specializations+via+neuroligins.">Neurexins induce differentiation of GABA and glutamate postsynaptic specializations via neuroligins.</a> Cell. 119, 1013-1026 (2004).</li><li>Dong, N., Qi, J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+reconstitution+of+functional+GABAergic+synapses+with+expression+of+neuroligin-2+and+GABAA+receptors.">Molecular reconstitution of functional GABAergic synapses with expression of neuroligin-2 and GABAA receptors.</a> Mol Cell Neurosci. 35, 14-23 (2007).</li><li>Fuchs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA(A)+receptors+can+initiate+the+formation+of+functional+inhibitory+GABAergic+synapses.">GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses.</a> Eur J Neurosci. 38, 3146-3158 (2013).</li><li>Ventimiglia, R., Lindsay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing nerve cells: Rat striatal neurons in low-density, serum-free culture. , 371-393 (1998).</li><li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localization+of+GABA(A)+receptor+subunits+in+relation+to+rat+striatopallidal+and+pallidopallidal+synapses.">Differential localization of GABA(A) receptor subunits in relation to rat striatopallidal and pallidopallidal synapses.</a> Eur J Neurosci. 33, 868-878 (2011).</li><li>Fritschy, J. M., Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA-receptor+heterogeneity+in+the+adult+rat+brain:+differential+regional+and+cellular+distribution+of+seven+major+subunits.">GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits.</a> J Comp Neurol. 359, 154-194 (1995).</li><li>Doig, N. M., Moss, J., Bolam, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+and+thalamic+innervation+of+direct+and+indirect+pathway+medium-sized+spiny+neurons+in+mouse+striatum.">Cortical and thalamic innervation of direct and indirect pathway medium-sized spiny neurons in mouse striatum.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 14610-14618 (2010).</li><li>Lalchandani, R. R., Vicini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+collaterals+in+genetically+identified+medium+spiny+neurons+in+mouse+primary+corticostriatal+cultures.">Inhibitory collaterals in genetically identified medium spiny neurons in mouse primary corticostriatal cultures.</a> Physiological reports. 1, (2013).</li><li>Nusser, Z., Sieghart, W., Benke, D., Fritschy, J. M., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+synaptic+localization+of+two+major+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptor+alpha+subunits+on+hippocampal+pyramidal+cells.">Differential synaptic localization of two major gamma-aminobutyric acid type A receptor alpha subunits on hippocampal pyramidal cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 11939-11944 (1996).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbiased+expression+screen+for+synaptogenic+proteins+identifies+the+LRRTM+protein+family+as+synaptic+organizers.">An unbiased expression screen for synaptogenic proteins identifies the LRRTM protein family as synaptic organizers.</a> Neuron. 61, 734-749 (2009).</li><li>Pettem, K. L., Yokomaku, D., Takahashi, H., Ge, Y., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+autism-linked+MDGAs+and+neuroligins+suppresses+inhibitory+synapse+development.">Interaction between autism-linked MDGAs and neuroligins suppresses inhibitory synapse development.</a> J Cell Biol. 200, 321-336 (2013).</li><li>Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+discovery+of+glypican+as+a+receptor+for+LRRTM4+in+regulating+excitatory+synapse+development.">Unbiased discovery of glypican as a receptor for LRRTM4 in regulating excitatory synapse development.</a> Neuron. 79, 696-711 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bien que ce protocole ne soit pas techniquement difficile à réaliser, il ya plusieurs étapes critiques qui doivent être suivies pour obtenir des analyses de co-culture les plus précis et reproductibles. Tout d&#39;abord, les neurones épineux moyens de culture doivent être ensemencées à une densité optimale. Si ensemencées trop peu, les neurones ont tendance à se développer très lentement et la survie est considérablement réduit. D&#39;autre part, si ensemencée trop dense, les neurones ont tendance à se regrouper ce qui compromet l&#39;analyse des contacts avec des cellules HEK293. En second lieu, il est recommandé d&#39;exprimer de manière transitoire un rapporteur fluorescent, la GFP ou mCherry dans des cellules HEK293 exprimant de manière stable GABA A R, avant de les platting dans la co-culture. Cela permet la reconnaissance fiable des cellules HEK293, qui peut être compromise par similitude de forme et de taille entre ces cellules et rare survivant cellule gliale dans des cultures de neurones. Pour réaliser la transfection efficace de la GFP ou mCherry ADNc, des lignées cellulaires HEK293 doivent être en phase exponentielle de croissance etensemencées à la densité appropriée dans des plaques à 6 puits. Ensemencement Sparse suivie par transfection entraîne la croissance de cellules mal, tandis que le sursemis empêche les cellules de prendre l&#39;ADNc. Idéalement, les cellules doivent être ensemencées de sorte qu&#39;ils sont entre 70 à 90% de confluence le jour de la transfection. En troisième lieu, la transfection doit être optimisée pour chaque lignée cellulaire utilisée, comme certaines lignées de cellules sont plus sensibles que d&#39;autres. En effet, le GABA Une expression constitutive de R dans les cellules HEK293 réduit la survie des cellules et la capacité des cellules à se redresser après la transfection. En outre, la survie dépend du type de GABA A Rs exprimés dans des cellules HEK293, avec certaines lignées de cellules étant significativement plus sensible que les autres. La transfection en utilisant un réactif de liposome est une méthode optimale pour l&#39;expression de protéines étrangères dans des lignées cellulaires à croissance rapide, assurant à la fois l&#39;efficacité de transfection élevée et le niveau d&#39;expression. Cependant, ce réactif provoque trop de dégâts à des lignées de cellules à croissance lente, pourque nous utilisons régulièrement un réactif de transfection non liposomale. Cela fonctionne d&#39;une manière semblable au réactif liposomique mais la quantité d&#39;ADN requise pour une transfection efficace est réduite de manière significative. Cela permet une meilleure survie des cellules (environ 80 - 90% contre 60% à l&#39;aide de réactifs liposomale), mais avec une efficacité de transfection plus faible (60%). Enfin, le nombre de cellules HEK293 de commande ou α1 / β2 / γ2 HEK293 exprimant cellules ajoutées à des cultures de neurones a besoin d&#39;être optimisé. Ajout de trop peu de cellules compromet le succès de l&#39;analyse des contacts entre les cellules et les neurones HEK293, car ils deviennent très rares. Inversement, l&#39;ajout d&#39;un trop grand nombre de cellules HEK293 provoque la mort des cellules neuronales dans les quelques heures. Des cultures de neurones épineux moyen embryonnaires devraient idéalement être préparés à partir de tissus prélevés sur des striatum embryonnaire âge de 15 ans - 17. Cependant, il arrive souvent que les embryons sont légèrement plus jeunes ou plus vieux que l&#39;âge optimal. Dans ce cas, le nombre de neurones dans la culture ensemencée serabesoin d&#39;être modifiée. Tissu qui est plus jeune que E15 peut avoir besoin d&#39;être ensemencées à une densité légèrement plus faible, tandis que le tissu qui est plus âgé que E17 peut avoir besoin d&#39;être ensemencées à une densité plus élevée, pour permettre la survie cellulaire optimale. En outre, la cytosine arabinoside (Ara-C) peut avoir besoin d&#39;être ajouté à des cultures plus anciennes pour éviter la croissance de cellules gliales, qui est plus abondant dans les tissus âgés. Lors de la création des co-cultures, il est important d&#39;optimiser le nombre de plaque de HEK293 transfectées ou / β2 / γ2 cellules HEK293 exprimant de α1, comme mentionné ci-dessus. Cependant, il peut être nécessaire de déterminer pour chaque ligne de cette cellule individuelle, en raison de leurs différences de survie. Typiquement, 30 000 cellules dans un volume maximum de 50 ul doivent être ajoutés à chaque puits d&#39;une plaque à 24 puits, qui contient déjà 500 ul de milieu de culture des neurones, car cela assure que le milieu neuronal conditionné ne soit pas trop dilué et que les conditions au sein de chaque bien rester assez constant, par exemple, </em&gt; La concentration de facteurs de croissance. Ajout de volumes de plus de 50 ul à chaque puits serait généralement tuer les neurones. L&#39;un des principaux inconvénients de la technique de co-culture est que les cultures de neurones sont créés à partir de cellules dissociées cultivés en monocouche, ce qui signifie que les neurones ont été enlevés de leur micro-environnement normal et sont incapables d&#39;établir leur organisation anatomique normale. Par conséquent, ils ne possèdent pas les connexions appropriées, les entrées et les molécules sécrétées par d&#39;autres cellules qui peuvent influer sur les premiers stades de développement des synapses. Par exemple, in vivo des neurones épineux moyens sont très innervée par des entrées glutamatergiques du cortex, le thalamus et d&#39;autres régions du cerveau 34, cependant, dans nos cultures de neurones glutamatergiques synapses ne forment pas parce que ces entrées sont endommagés lors de la dissection du tissu striatal. Comment l&#39;absence de synapses glutamatergiques fonctionnels dans les neurones épineux moyens culture affECTS leur capacité à former des synapses GABAergiques uns avec les autres et / ou les cellules HEK293 exprimant GABA A R reste une question ouverte. Cette question pourrait être facilement traitée par la culture de neurones épineux moyens avec les neurones glutamatergiques corticaux leur permettant ainsi de former des synapses fonctionnelles 35 avant l&#39;addition des cellules HEK293. Une autre approche serait de concevoir un système de modèle de co-culture basée sur des cultures organotypique, qui maintiennent une partie de la cytoarchitecture qui peut être important pour la maturation et la formation des synapses. Cependant, les cultures organotypique ont neuropile dense et hétérogène qui peut compromettre l&#39;analyse effectuée ici. Un autre inconvénient important de l&#39;utilisation des tests de co-culture est que le GABA A Rs exprimé à la surface des cellules HEK293 sont pas regroupés comme ils sont dans les neurones, bien que cela ne semble pas être nécessaire pour la formation des synapses donné une assez forte expression de surface 30. Par exemple, dans le rOdent cerveau et dans les cultures de l&#39;hippocampe, l&#39;α1 GABA A R sous-unité se trouve dans la plupart des synapses GABAergiques sur tous les domaines post-synaptiques des cellules pyramidales. Cependant, l&#39;α2 est spécifiquement situé dans un sous-ensemble de synapses sur le soma et des dendrites, mais est fortement enrichie dans le segment initial axone, comme l&#39;a révélé par immunofluorescence et microscopie électronique 36. Étant donné que la formation des synapses dans les co-cultures peut toujours être détectée de manière fiable et analysé 30, ce qui suggère que la densité de GABA A R à la surface cellulaire de cellules HEK 293 peut être similaire à, ou même supérieure à la densité de ces récepteurs au sein synaptique grappes dans les neurones. Cela peut expliquer, au moins en partie, pourquoi les protéines synaptiques d&#39;adhérence, comme neuroligin, et des protéines de la densité post-synaptique, comme géphyrine, ne sont pas nécessaires pour la formation des synapses dans les co-cultures, si les assemblées de manière appropriée Rs GABA A sont présents à suffisamment densité. Il est bien documenté que le GABA A R sont structurellement et fonctionnellement hétérogène, et que la composition de sous-unité du récepteur détermine leur localisation sous-cellulaire et des propriétés pharmacologiques. Par exemple, l&#39;incorporation des deux sous-unités est connu pour être une condition préalable à la localisation synaptique du GABA A Rs tandis que la sous-unité est presque exclusivement présente dans extrasynaptiques Rs GABA A. Les récepteurs qui intègrent seulement αβ combinaisons sont également pensés pour être principalement localisée aux domaines extrasynaptiques 12- 14. Que cette spécificité est maintenue dans le système de co-culture peut être facilement testée par transfection transitoire ou deux sous-unités d&#39;ADNc dans des lignées de cellules HEK293 exprimant de manière stable les sous-unités α et β, avant leur addition à des cultures de neurones. Nos expériences préliminaires utilisant cette approche ont suggéré que des contacts synaptiques sont facilement formés seulement en présence de la sous-unité 2, ce qui indique que la spécificitéficité observé in vivo est susceptible d&#39;être conservé in vitro (données non présentées). En outre, Rs GABA A incorporant différentes sous-unités α sont localisées de façon sélective à des contacts synaptiques formés avec des types spécifiques de neurones présynaptiques. Par exemple, dans le globus pallidus, les Rs α1-GABA A sont généralement trouvés à striatopallidaux (str-GP) et palliopallidal (GP-GP) synapses, qui sont situés sur les dendrites et les régions somatiques des neurones épineux moyens, respectivement. Les Rs α3-GABA A sont situés dans des régions périsomatique de neurones épineux moyens et sont contactés par des collatéraux GP axonales locales, tandis que les Rs α2-GABA A sont situés sur les dendrites distales de ces neurones et contacté principalement par les contributions de la striatum 32. Expression de sous-unités α spécifiques des différents types de synapses et de neurones dans différents compartiments a également été démontrée dans d&#39;autres zones du cerveau telles que Hippocampus 21 et le néocortex 18,20. Ces résultats soulèvent la question de savoir comment les synapses inhibitrices spécifiques sont formées dans le cerveau. Est-ce que l&#39;adhésion d&#39;un type spécifique de terminaison présynaptique induit l&#39;insertion de sous-types spécifiques GABA A R dans les points de contact? Est-ce que les récepteurs d&#39;un trafic à des emplacements subcellulaires spécifiques en fonction de leur composition de sous-unité, où l&#39;insertion de la membrane plasmique est une condition préalable à l&#39;adhésion des terminaisons axonales d&#39;origine spécifique? À ce jour, ces questions restent sans réponse. L&#39;utilisation de systèmes modèles réduits, tels que le système de modèle de co-culture, nous permet de commencer à répondre à ces interrogations complexes parce que le système est facilement prêter à la transfection de constructions d&#39;ADN et de l&#39;application des réactifs et, surtout, il est adapté pour le live analyse de l&#39;imagerie cellulaire 30. Ainsi, en utilisant ce système modèle, nous pouvons commencer à tester le rôle de molécules individuelles, y compris les différents types de GABA A R, savoirn d&#39;être présent à des contacts synaptiques. Un autre avantage est que les synapses dans ce modèle sous forme de système rapidement, en quelques minutes à quelques heures, la réduction de la durée d&#39;expériences. Systèmes de modèle de co-culture similaires ont été utilisés avec succès dans le passé à l&#39;écran pour les nouvelles molécules synaptogenic 27,37,38. Comprendre comment le système nerveux central se développe, mûrit et forme les connexions entre les neurones de manière si complexe à contrôler, par exemple, le comportement ou la cognition, est d&#39;une importance fondamentale. Cet objectif lointain ne sera atteint que par la délimitation des mécanismes moléculaires qui régissent les différentes étapes de la reconnaissance et de la communication cellule à cellule au cours du développement. En raison de la complexité pure, les détails moléculaires de ces interactions cellulaires multiples peuvent actuellement être étudiés avec précision que dans les systèmes réduits. Toutefois, la capacité d&#39;augmenter la complexité de ces systèmes par l&#39;expression de multiples combinaisons de protéines et d&#39;étudier commentils interagir présente certains avantages en comparaison avec, par exemple, les méthodes de suppression génétiques. En effet, l&#39;interprétation exacte des effets de la suppression d&#39;un gène unique est souvent compromise par des changements associés à des mécanismes de compensation des effets de masquage des lésions d&#39;origine, en particulier dans le cerveau en développement. La technique simple de co-culture mais informatif décrit ici a permis la découverte du rôle de structure de GABA A R dans la formation des synapses et ouvert la possibilité d&#39;étudier la façon dont Rs GABA A et d&#39;autres molécules d&#39;adhérence cellulaire et / ou des protéines de la matrice synaptiques interagissent les uns avec les autres au cours de la synaptogenèse. Protéines de la matrice synaptique sont un intérêt particulier étant donné qu&#39;ils ont été récemment démontré à jouer un rôle clé dans la formation des synapses glutamatergiques 39. Le développement de modèles de co-culture est importante, car ils ont le potentiel de faire progresser notre connaissance des mécanismes moléculaires qui régissent la «normale &amp;# 8217; le développement du cerveau et ainsi augmenter notre compréhension de la façon dont ces mécanismes sont modifiés dans de nombreuses maladies neurologiques du développement, tels que l&#39;épilepsie, la schizophrénie, les troubles du spectre autistique et bien d&#39;autres.

Le GABA est un des premiers neurotransmetteurs dans le cerveau embryonnaire, qui précède le neurotransmetteur excitateur le plus abondant une glutamate. Au cours du développement, le GABA dépolarise et excite les neurones immatures, jouant un rôle clé dans la régulation de la prolifération cellulaire, la migration et la formation de réseaux de neurones sans induire excitotoxicité. Dans le cerveau adulte, le potentiel d&#39;inversion de GABA A du récepteur de canaux est déplacée vers des potentiels plus négatifs en raison d&#39;une diminution de la concentration intracellulaire de chlorure. Ce changement est provoqué par la régulation positive de la potassium-chlorure de co-transporteur (KCC2), qui transporte le chlorure hors de la cellule, et, en parallèle, la régulation négative de la sodium-potassium-chlorure transporteur (NKCC1), qui a l&#39;effet inverse 2. Dans le cerveau, le GABA se lie principalement aux récepteurs GABA A soit B ou GABA à la médiation inhibition synaptique rapide ou lent, respectiveLy. GABA A R sont une classe de récepteurs ionotropiques également connus sous le nom heteropentameric ou canaux ioniques Cys-boucle ligand-dépendants. Deux molécules de GABA sont nécessaires pour l&#39;activation du récepteur, qui est perméable aux ions chlorure et dans une moindre mesure, des ions bicarbonate. L&#39;augmentation de la conductance du chlorure diminue l&#39;efficacité de la dépolarisation, les événements excitateurs dans l&#39;activation du neurone postsynaptique 3. La diversité structurale de GABA A Rs est reconnue depuis longtemps comme un facteur clé dans la détermination de leur large éventail de propriétés fonctionnelles et pharmacologiques. Natif GABA A R sont des hétéro-pentamères composés de sous-unités avec plusieurs isoformes classés comme: α (1-6), β (1-3), γ (1-3), δ, ε, π et θ 3, avec une commune topologie transmembranaire comprenant un grand domaine N-terminal extracellulaire, quatre domaines transmembranaires (TMS), et un domaine intracellulaire majeure entre les MT 3 et 4 4. Leβ3 et γ2 sous-unités sont essentielles pour l&#39;inhibition synaptique et la survie de l&#39;organisme, parce que les souris portant suppression génétique de ces sous-unités meurent après la naissance 5,6. En revanche, les isoformes individuelles de la sous-unité α sont importants pour la fonction de connexions synaptiques spécifiques du cerveau associée à des comportements différents tels que l&#39;anxiété, la sédation, excitation, et d&#39;autres, mais ne sont pas, individuellement, indispensable à la vie 9.7. GABA A Rs sont les principaux sites d&#39;action pour une variété de médicaments avec sédatif puissant, hypnotique, anxiolytique et effets anticonvulsivants, tels que les benzodiazépines, les barbituriques, les neurostéroïdes et anesthésiques 7,10,11. Synaptic GABA A R contiennent généralement une sous-unité γ2, deux sous-unités β (plus communément β2 ou β3) et deux sous-unités α (α1, α2, α3 ou α5) 12,13. La classe prédominante des récepteurs extra-synaptique contient la sous-unité δ en combinaisonavec deux sous-unités α de (α4 ou α6), et les deux sous-unités β (β2 ou β3) 14. Localisation subcellulaire de GABA A Rs aux axones ou dendrites, soma et l&#39;insertion dans la membrane plasmique est dépendante de la présence de sous-unités β 15,16. Cependant, l&#39;incorporation sélective de différents sous-types GABA A R dans différents types de synapses est bien corrélée avec la présence de sous-unités α spécifiques (α1, α2, α3 ou α5) 7,17,18. Surtout, la suppression de la sous-unité α1 ou α2 chez la souris provoque des changements ultrastructuraux au niveau des synapses inhibitrices 19. Ceci suggère que le GABA A se RS peut jouer un rôle direct dans la régulation de la formation des synapses. Les données indiquent que le développement des synapses GABAergiques est une séquence précisément coordonné des événements, dans laquelle les deux cibles neuronales contactés par différents types d&#39;axones inhibiteurs et les récepteurs qui sont regroupés auchaque classe de synapses inhibitrices sont sélectifs et fonctionnellement à l&#39;écoute 17,20-22. Ce principe fondamental de la spécificité au niveau des synapses GABAergiques soulève la question de savoir comment les partenaires avant et post-synaptiques se reconnaissent mutuellement lors de l&#39;initiation de contacts synaptiques. Les essais in vitro de co-culture ont été appliquées avec succès pour étudier certains des mécanismes de la formation des synapses et de tester le rôle des protéines transmembranaires lièvre synaptiques individuels dans ce processus. Un des trans-synaptiques interaction combinaisons de protéines communes qui fonctionnent de façon bidirectionnelle à la médiation la formation des synapses et la maturation, sont la neurexines (Nrxns) et neuroligines (LN). Nrxns sont des protéines qui présentent présynaptiques épissage alternatif à l&#39;intérieur de leurs domaines de protéines de liaison à l&#39;hormone de la laminine-neurexine sexe, ce qui donne lieu à de nombreuses isoformes différentes 23. Alors que le Nrxns également interagir avec d&#39;autres protéines, LN sont pensés pour être leur omniprésent pa post-synaptiquemes partenaires 24. Ensemble, ces protéines contribuent à maintenir les membranes présynaptiques et post-synaptiques en étroite et rigide apposition 25. Les deux isoformes les plus abondantes sont NL-1 et F-2 qui sont présents à excitateurs et inhibiteurs synapses, respectivement 26. L&#39;un des premiers systèmes de modèles de co-culture, conçues pour étudier les interactions de protéines trans-synaptique, employer différents types de cellules non neuronales, des lignées cellulaires les plus couramment immortelles tels que rein embryonnaire humain (HEK), des cellules 293, à NL- surexpriment 2. Lorsque ces cellules ont été cultivées avec les neurones pontique, une accumulation de protéines présynaptiques à proximité immédiate de la surface des cellules HEK a été observée, ce qui indique la formation de contacts synaptiques analogue. Ajout de soluble β-neurexine à ces co-cultures inhibé la formation de contacts, ce qui suggère que les interactions trans-synaptiques entre Nrxns et LN sont nécessaires pour la formation de contact synaptique 27. En outre, l&#39;expression transitoirede β-neurexine en COS de cellules (C V-1 (simien) en O rigine, et transportant le matériel génétique S V40) en co-culture avec glutamatergique hippocampique dissocié et les neurones GABAergiques expression induite de la gephryin protéique post-synaptique et de sous-unités GABA A R γ2 et α2 aux points de contact entre ces deux types de cellules 28. Un autre exemple d&#39;un modèle de co-culture utilisé pour étudier la formation des synapses impliqué cellules HEK293 transfectées de manière transitoire, avec sous-unités GABA A R α2 / β3 / γ2 et NL-2, et d&#39;une population mixte de 29 neurones hypothalamiques. Cette étude a conclu que l&#39;expression de NL-2 est une exigence absolue pour la formation de synapses inhibitrices. Α1 Cependant, dans la récente étude de co-culture, transfectées de façon stable / β2 / γ2 GABA A R dans les cellules HEK293 ont été jugées suffisantes pour induire des synapses fonctionnelles en cas de co-cultivées avec des med GABAergiquesneurones épineux ium, sans avoir besoin de protéines supplémentaires d&#39;adhésion trans-synaptiques ou post-synaptiques. Cependant, on a observé une augmentation importante dans la formation des synapses et la force quand NL-2 a été co-exprimé avec GABA A Rs 30. Cela indique que ce système de modèle de co-culture a des avantages sur les systèmes de modèles décrits précédemment, plus évidemment une augmentation de la sensibilité et de la fiabilité de la détection de contact synaptique. Deux facteurs importants qui contribuent à l&#39;amélioration globale de détection de contacts synaptiques sont: i) l&#39;utilisation de transfectées de façon stable lignées cellulaires HEK293 avec expression élevé et uniforme de sous-unités GABA A R à la surface des cellules individuelles. Cette cohérence facilite les comparaisons quantitatives entre les différentes conditions de co-culture. ii) L&#39;utilisation d&#39;une population pure de GABAergiques neurones épineux moyens du striatum en culture de l&#39;embryon 31 élimine les complications et les ambiguïtés résultant de l&#39;utilisation de populations neuronales mixtes et allows, par exemple, la sélection des types les plus appropriées post-synaptiques GABA A R qui peuvent être comparés les uns avec les autres pendant la formation des synapses. Formation des synapses est pensé pour impliquer de nombreux signaux trans-synaptiques au sein des complexes d&#39;adhérence cellulaire pré et post-synaptiques. En raison de la nature bidirectionnelle de signalisation synaptique et le nombre considérable de molécules d&#39;adhérence cellulaire, il est difficile d&#39;identifier les éléments clés impliquées dans la formation des synapses. Ainsi, la transfection d&#39;une seule protéine d&#39;adhésion cellulaire dans une cellule non-neuronale (dans ce cas, les deux cibles post-synaptiques les plus répandues pour GABAergiques neurones épineux moyens in vivo, α1 / β2 / γ2 ou α1 / β3 / γ2 GABA A Rs 32) considérablement réduit la complexité des signaux trans-synaptique disponibles à la surface post-synaptique et permet une analyse quantitative précise de l&#39;efficacité de cette protéine dans la promotion de la formation des synapses.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1601">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Name</td>
			<td style="width:627px;">Company/Individual</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:396px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Serum)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11960-044</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">25030-024</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15070-063</td>
			<td style="width:396px;">Danger: irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10106-169</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Neurobasal</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">21103-049</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">B27 Supplement</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">17504-044</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Glucose</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G8769</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">HBSS (10X)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14180-046</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15630-056</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">PBS (1X)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10010-031</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection)</td>
			<td rowspan="2" style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">V790-20</td>
			<td rowspan="2" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">V860-20</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">V870-20</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Stable HEK&#945;1&#946;2&#947;2 line</td>
			<td style="width:627px;">Sanofi-Synthelabo, Paris</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P1149</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">G418 disulfate salt (Geneticin)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G5013</td>
			<td style="width:396px;">Danger: irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Phleomycin D1 (Zeocin)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">R25001</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10687-010</td>
			<td style="width:396px;">Danger: toxic, irritant and corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">25300-054</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use Danger: Irritant.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P6282</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Laminin</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">L2020</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">100 &#956;m Nylon Cell Strainer</td>
			<td style="width:627px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">734-0004</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (Ara-C)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C1768</td>
			<td style="width:396px;">Danger: Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Chelating agent (Versene)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15040-033</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:469px;">liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent).</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15338-100</td>
			<td style="width:396px;">Alternative transfection method: Effectene Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent)</td>
			<td style="width:627px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:111px;">301425</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Reduced serum medium (Opti-MEM)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11058-021</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5</td>
			<td style="width:627px;">Synaptic Systems</td>
			<td style="width:111px;">105311C5</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Neurobasal A</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10888-022</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:627px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:111px;">27810.364</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Glycine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G1726</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A3294</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:469px;">Guinea pig anti-&#947;2 GABAA receptor antibody</td>
			<td style="width:627px;">Prof. Jean Marc Fritschy</td>
			<td rowspan="3" style="width:111px;">N/A</td>
			<td rowspan="3" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">(Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, J.M and Mohler, H.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:627px;">J. Comp. Neurol. 359 (1) 154&#8211;194 (1995).</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:627px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">H5141</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">MAB351</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-synapsin antibody</td>
			<td style="width:627px;">Synaptic Systems</td>
			<td style="width:111px;">106-011</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-&#946;2/3 antibody (BD17)</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">MAB341</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:469px;">Rabbit anti-&#945;1 GABAA receptor antibody</td>
			<td style="width:627px;">Professor Anne Stephenson</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">N/A</td>
			<td rowspan="2" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:627px;">(UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al., J. Comp. Neurol.416 (2) 158-172.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">AP1085</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">AP124S</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A31553</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A21422</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A11008</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;"><a name="RANGE!A49">Mounting reagent (Prolong Gold)</a></td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">P36930</td>
			<td style="width:396px;">Use at room temperature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inhibitory synapse formation in a co-culture model incorporating gabaergic medium spiny neurons and hek293 cells stably expressing gabaa receptors

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (&#947;-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials. 
During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other. 
To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.

Le protocole de ce système de modèle de co-culture de cellules HEK293-neurone a été finement réglé pour permettre la survie cellulaire optimale. Dans ce système, la formation de contacts synaptiques-comme et leur analyse repose sur une expression stable et uniforme de tous les trois sous-unités GABA A R qui assemblent en un récepteur fonctionnel. Il est donc important d&#39;utiliser l&#39;analyse immunocytochimique à l&#39;essai pour l&#39;expression de la sous-unité à la surface de la cellule HEK293 avant de les ajouter à des cultures de neurones. Dans ces expériences, l&#39;expression de surface cellulaire de α1, β2 et des sous-unités γ2 (figure 1A), ou α1, β3 et γ2 sous-unités (figure 1b), a été détectée en utilisant des anticorps spécifiques de sous-unités qui se lient à des epitopes extracellulaires de ces sous-unités. Un degré élevé de co-localisation entre ces sous-unités à la surface HEK293 a été démontrée. Après confirmation de l&#39;expression de surface et co-localisation de GABA ALes sous-unités R dans des cellules HEK293, des co-cultures ont été préparées en utilisant des cellules HEK293 exprimant les sous-unités α1 / β2 / γ2 GABAA et R neurones épineux moyens cultivées pendant 14 jours (14 jours in vitro (DIV)). Les cellules de co-culture ont été incubées pendant 24 heures, fixées et analysées en utilisant l&#39;immunocytochimie et microscopie confocale. Analyse des contacts indiqué que GABAergiques terminaisons axonales de GAD65 positif formés que des contacts sporadiques avec le contrôle des cellules HEK293 (Figure 2A, 2B). Le nombre de contacts détectés à 4 heures était de 7,3 ± 0,9 par cellule HEK293, et ce nombre a été réduit à 5,5 ± 0,5 connexions (moyenne ± SEM) par cellule HEK293 à 24 heures après l&#39;ajout de cellules HEK293 pour les neurones en culture. En revanche, les terminaux GAD65 positifs axonales GABAergiques formés de nombreux contacts synaptiques comme avec des cellules HEK293 exprimant GABA A Rs. Le nombre de contacts obtenus à 4 heures après l&#39;ajout de cellules HEK293 était de 28,3 ± 4,7 par cellule HEK293, et ce nombre était nouvelle augmentationd à 52,1 ± 6,3 (moyenne ± SEM) par cellule HEK293 à 24 h en co-culture (Figure 2A, 2B). Pour déterminer si ces contacts synaptiques comme étaient «actif», c.-à-soutenu la libération du transmetteur vésiculaire, un anticorps conjugué Cy5 vésicule-luminale domaine spécifique anti-synaptotagmine a été ajouté au milieu de co-culture après 23 heures d&#39;incubation. Cet anticorps est seulement incorporée dans les terminaisons nerveuses présynaptiques quand un pore se forme entre la lumière de vésicules synaptiques et le fluide extracellulaire dans la fente synaptique au cours de la libération de neurotransmetteurs. Suite à la publication, le pore se referme, laissant le synaptotagmine anticorps fluorescent Cy5 conjugué attaché à synaptotagmine l&#39;intérieur de la vésicule. De cette façon, seuls les vésicules qui participent activement à la libération de neurotransmetteurs sont marqués avec l&#39;anticorps. Dans ces expériences, peu ou pas de contacts entre le contrôle des cellules HEK293 et ​​les bornes de neurones épineux moyens étaient «actifs &amp; #8217; comme montré par l&#39;absence de co-localisation entre la présynaptique GAD65 / synaptotagmine fluorescence et mCherry fluorescence dans des cellules HEK293 (figure 3A). En revanche, de nombreux contacts «actifs» ont été formés entre les bornes épineux de neurones moyennes et α1 / β2 / γ2 exprimant cellules HEK293, comme l&#39;a révélé un degré élevé de co-localisation entre GAD65 / synaptotagmine et mCherry, exprimé spécifiquement dans les cellules HEK293 ( Figure 3B). Α1 Pour tester si un autre sous-type de GABA A R peut également favoriser la formation de la synapse comme in vitro, nous avons co-culture / β3 / γ2 exprimant cellules HEK293 avec les neurones épineux moyens. Encore une fois, les cellules de contrôle HEK293 ont rarement reçu des contacts avec des terminaisons présynaptiques Synapsin positif atteignant 10,8 ± 0,48 (moyenne ± SEM) contacts par cellule HEK293 après 24 h en co-culture (figure 4A gauche, 4B). Cependant, les cellules HEK293 exprimantα1 / β3 / γ2 forme GABA A Rs beaucoup plus de contacts synaptiques comme avec les terminaux présynaptiques Synapsin positif de neurones épineux moyens atteignant 25,3 ± 0,27 (moyenne ± SEM) contacts par cellule HEK293 après 24 h en co-culture (Figure droit 4A, 4B). Ceci indique que α1 / β3 / γ2 GABAA R exprimé dans des cellules HEK 293 sont également capables de favoriser la formation de contact synaptique, bien que leur efficacité est inférieure à la puissance de α1 / β2 / γ2 GABAA contenant Rs. Ces expériences indiquent que le système de co-culture modèle développé dans notre laboratoire permet une analyse quantitative de la formation de contact synaptique in vitro ainsi que l&#39;évaluation de l&#39;efficacité de différents sous-types de GABA A R dans ce processus. Ces expériences démontrent en outre que Rs GABA A, en plus d&#39;être des composants fonctionnels critiques de synapses GABAergiques, peuvent jouer un rôle clédans le processus de reconnaissance et de formation de contacts synaptiques entre les neurones inhibiteurs et les cellules neuronales cibles appropriées, indépendamment des autres protéines d&#39;adhésion synaptiques. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" width="600" /> Figure 1. immunocytochimique analyse de l&#39;expression de GABA A R α1 / β2 / γ2 ou α1 / β3 / γ2 dans des lignées stables de cellules HEK293. Les anticorps qui reconnaissent les domaines extracellulaires des sous-unités GABA A R ont été utilisés pour les récepteurs d&#39;étiquettes exprimées à la surface cellulaire. ( A) lignée cellulaire HEK293 α1 exprimer (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) et γ2 (Cy5) à des niveaux élevés. (α1 B) lignée cellulaire HEK293 exprimant (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) et γ2 (Cy5)sous-unités à des niveaux élevés. Barre d&#39;échelle:. 10 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" width="600" /> Figure 2. GABAergiques neurones épineux moyens forment des contacts avec α1 / β2 / γ2- synapse comme exprimant les cellules HEK293 en co-culture. (A) de marquage fluorescent des terminaisons présynaptiques avec des anticorps anti-GAD65 (en vert) et les cellules HEK293 avec mCherry (en rouge, à gauche) ou le GABA A R γ2 sous-unité (en bleu, à droite), les points de co-localisation entre ces révélé marqueurs indiquant la formation de contacts synaptiques comme après 4 ou 24 h en co-culture. Barre d&#39;échelle:. 10 pm (B) L&#39;analyse quantitative de la synapse comme co<html> ntacts. Cellules HEK293 ont été identifiés en fonction de leur forme comme révélé par DIC imagerie et / ou l&#39;expression mCherry, et le nombre de contacts entre GAD-65 puncta positif (en vert) et la surface des cellules HEK293 a été compté par l&#39;œil dans chaque section optique d&#39;un série Z-stack (8 - 10) par cellule en utilisant le logiciel d&#39;imagerie, et exprimée en nombre de contacts / cellule. Le graphique indique le nombre de contacts entre les neurones moyennes épineux et le contrôle des cellules HEK293 (gris clair) ou / β2 cellules / γ2-HEK293 α1 (noir) après 4 et 24 h en co-culture (moyenne ± SEM, n = 8 dans chaque état de deux expériences indépendantes). Ce chiffre a été modifié depuis Fuchs et al. (2013) 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <html> AD / 52115 / 52115fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Figure 3. GABA A Rs favorisent la formation de contacts synaptiques actifs. Immunomarquage de contacts synaptiques comme formées après 24 heures de co-culture entre neurones terminaux épineux moyens positifs pour GAD65 (Alexa Fluor 405 cyan) et (a) contrôle les cellules HEK293, ou (B) HEK293-α1 / β2 / γ2, les deux cellules transfectées de manière transitoire avec mCherry construire (rouge). Contacts actifs sont identifiés par la co-localisation entre le domaine spécifique vésicule luminale anticorps anti-synaptotagmine (Cy5) et anticorps spécifique de GAD65 fois dans les terminaux présynaptiques, et mCherry exprimés dans des cellules HEK293. Barre d&#39;échelle:. 10 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig3highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> igure 4 &quot;fo: contenu width =&quot; 6 pouces &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52115 / 52115fig4highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Figure 4. GABAergiques neurones épineux moyens forment des contacts synaptiques comme avec α1 / β3 / sous-unité γ2- exprimant cellules HEK293 en co-culture. (A) Le marquage fluorescent des terminaisons présynaptiques avec anti-synapsine I anticorps (en vert), et de contrôle des cellules HEK293 (à gauche), ou α1 / β3 / γ2 cellules exprimant HEK293, à la fois transfectées de façon transitoire avec mCherry (en rouge), points de révélé co-localisation entre ces marqueurs indiquant la formation de contacts synaptiques semblable après 24 h en co-culture. Barre d&#39;échelle: 10 pm (B). L&#39;analyse quantitative des contacts synaptiques-like. Les cellules HEK293 ont été identifiés par l&#39;expression mCherry, et le nombre de contacts entre synapsine I-positif puncta (en vert) et la surface de cellules HEK293 a été compté par l&#39;oeil dans chaque section optique une série de Z-pile (8 - 10) par cellule en utilisant un logiciel d&#39;imagerie, et exprimés en nombre de contacts / cellule. Le graphique indique le nombre de contacts entre les neurones épineux moyens et le contrôle des cellules HEK293 (gris clair) et / ou β3 cellules / γ2-HEK293 α1 (noir) après 24 h en co-culture (moyenne ± SEM, n = 8-12 cellules chaque état, de deux expériences indépendantes). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig4highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Les mécanismes moléculaires qui coordonnent la formation des synapses GABAergiques inhibiteurs cours de l&#39;ontogenèse sont largement inconnus. Pour étudier ces processus, nous avons développé un système de modèle de co-culture qui intègre les neurones GABAergiques épineux moyen embryonnaires cultivées avec transfectées de façon stable rein embryonnaire humain 293 (HEK293) des cellules exprimant des récepteurs GABA fonctionnels A.

Inhibiteur formation des synapses dans une co-culture modèle intégrant GABAergiques moyennes épineux neurones et les cellules HEK293 exprimant de façon stable GABA<sub&gt; A</sub&gt; Récepteurs

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

17.3K vues.  University College London.  Les mécanismes moléculaires qui coordonnent la formation des synapses GABAergiques inhibiteurs cours de l'ontogenèse sont largement inconnus. Pour étudier ces processus, nous avons développé un système de modèle de co-culture qui intègre les neurones GABAergiques épineux moyen embryonnaires cultivées avec transfectées de façon stable rein embryonnaire humain 293 (HEK293) des cellules exprimant des récepteurs GABA fonctionnels A. 

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Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

Live-imagerie de la translocation de la PKC dans les cellules Sf9 et dans les neurones sensoriels aplysie

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

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Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Didermique co-culture de neurones de rat corticale primaire et des cellules gliales

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Isoler LacZ cellules exprimant des tissus de la souris oreille interne par cytométrie en flux

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Une unité fonctionnelle du moteur dans la boîte de culture: La co-culture d&#39;explants de la moelle épinière et les cellules musculaires

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Les ganglions rachidiens neurones et les cellules souches différenciées dérivées de tissu adipeux: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-culture modèle pour étudier la régénération des nerfs périphériques

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

Visualisation de Thalamocortical Axon Branching et Synapse Formation chez organotypique Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

Culture de cellules primaires de neurones GABAergiques ou glutamatergiques purifiés établis par tri cellulaire activé par fluorescence

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

Migrations, Chemo-Attraction et Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons (en anglais)

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials through saltatory conduction. Moreover, an increasing number of reports suggest that oligodendrocytes interact with neurons beyond myelination, notably through the secretion of soluble factors. Here, we present a detailed protocol allowing purification of oligodendroglial lineage cells from glial cell cultures also containing astrocytes and microglial cells. The method relies on overnight shaking at 37 &#176;C, which allows selective detachment of the overlying oligodendroglial cells and microglial cells, and the elimination of microglia by differential adhesion. We then describe the culture of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium (OCM). We also provide the kinetics of OCM treatment or oligodendrocytes addition to purified hippocampal neurons in co-culture experiments, studying oligodendrocyte-neuron interactions.

Herein, we display an efficient method for the purification of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium that can be used for co-culture experiments.

Génération d’Oligodendrocytes et de médium conditionné par oligodendrocyte s’est conditionné pour les expériences de co-culture

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a single-cell electroporation technique that maximizes the efficiency (~80%) of in vitro gene transfection in excitatory and class-specific inhibitory neurons in mouse organotypic hippocampal slice culture. Using large glass electrodes, tetrodotoxin-containing artificial cerebrospinal fluid and mild electrical pulses, we delivered a gene of interest into cultured hippocampal CA1 pyramidal neurons and inhibitory interneurons. Moreover, electroporation could be carried out in cultured hippocampal slices up to 21 days in vitro with no reduction in transfection efficiency, allowing for the study of varying slice culture developmental stages. With interest growing in examining the molecular functions of genes across a diverse range of cell types, our method demonstrates a reliable and straightforward approach to in vitro gene transfection in mouse brain tissue that can be performed with existing electrophysiology equipment and techniques.

Presented here is a protocol for single-cell electroporation that can deliver genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice culture ages. Our approach provides precise and efficient expression of genes in individual cells, which can be used to examine cell-autonomous and intercellular functions.

Électroporation unicellulaire à travers différentes cultures de tranches organotypiques de neurones excitateurs excitateurs de l’hippocampe de souris et de neurones inhibiteurs spécifiques à une classe

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...