Les préparations de surface cochléaires permettent la visualisation de l’objectif entier de l’organe de Corti à l’aide de l’immunohistochimie et de l’imagerie confocale. Il a été largement utilisé pour l’investigation de pathologies cochléaires spécifiques d’intérêt. Nous modifierons la méthode de microdissection cochléaire.
Le principal avantage de cette technique est l’adhérence d’un morceau d’épithélium cochléaire à 10 millimètres de couvertures rondes pour la procédure d’immunolabeling tout en évitant la perte de tissu pendant les étapes multiples de lavage. En outre, les pathologies cochléaires, la préparation de surface cochléaire peut également être utilisé pour l’expression d’évaluation et la régénération des cellules capillaires. Des compétences de base au microscope sont requises pour cette technique et la démonstration visuelle de la méthode peut aider à s’assurer que chaque étape est effectuée correctement.
Qiaojun Fang, un étudiant diplômé de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour l’extraction temporelle d’os, immédiatement post-mortem tirer la peau antérieurement pour exposer l’os du crâne et utiliser des ciseaux pour couper l’os de l’aspect postérieur vers l’avant le long de la ligne centrale du crâne. Utilisez des forceps pour enlever le tissu cérébral avant d’utiliser le pouce et l’index pour enlever manuellement les os temporels des souris âgées de trois mois ou plus.
Placez les os dans une boîte Petri de 30 millimètres de diamètre contenant de la glace fraîche froide 4%PFA et PBS sous un microscope de dissection et retirez les stapes de la fenêtre ovale. Percer la membrane de la fenêtre ronde avec le nombre cinq forceps et utiliser une aiguille de calibre 27 attaché à une seringue d’un millilitre contenant frais 4%PFA pour faire un petit trou dans le sommet de la cochlée. Imprèflez doucement et lentement la cochlée avec une solution fixative via les fenêtres rondes et ovales jusqu’à ce que la solution se lave du petit trou à l’apex.
Ensuite, transférez jusqu’à deux cochlées perfusées dans des flacons individuels de scintillation de 20 millilitres contenant 10 millilitres de 4 %PFA par flacon et agitez doucement les échantillons pendant deux heures à température ambiante, suivis d’un stockage de nuit à quatre degrés Celsius sur un rotateur. Le lendemain matin, lavez le cochlée avec trois lavages de cinq minutes avec du PBS frais par lavage. Après le dernier lavage, ajouter 20 millilitres de 4%EDTA à chaque flacon et faire pivoter les échantillons pendant 48 heures à quatre degrés Celsius avec une agitation douce.
À la fin de l’incubation, toucher la partie vestibulaire osseuse de chaque cochlée avec des forceps pour évaluer l’élasticité des échantillons. Si les os sont élastiques plutôt que fermes, la cochlée a été décalcifiée. Remplacez l’EDTA pour chaque échantillon par du PBS frais.
Pour la microdissection de l’épithélium cochléaire, saisir la partie vestibulaire de l’os temporal avec des forceps et utiliser un scalpel pour couper le virage apical à un angle de 45 degrés. Couper verticalement le long de la ligne faible entre la fenêtre ronde et la fenêtre ovale pour séparer la cochlée de la partie vestibulaire et orienter la partie cochléaire avec le virage basal vers le bas et le milieu tourne vers le haut de la boîte de Pétri. De cette position, couper la capsule osseuse et la paroi latérale du virage moyen vers l’extrémité d’où la section apical a été enlevée et continuer à couper pour séparer complètement la partie moyenne des régions basales et crochet.
Placer la partie basale et crochetée avec le site de la membrane basilaire orientée vers le fond du plat, couper verticalement le médialis de la région du crochet pour enlever les médialis et couper les régions basales et crochet pour séparer la partie du crochet. Pour éviter la distorsion du tissu, coupez le médialis hors de la région d’hameçon avant la séparation du tour basal et de la région d’hameçon. Couper les portions relativement grandes de capsule osseuse et de tissu latéral de la paroi du virage moyen et tenir la paroi latérale avec des forceps pour aligner la capsule osseuse et la paroi latérale avec le fond de la boîte de Pétri, couper ces tissus du côté de la membrane basilaire.
Ensuite, aplatissez le spécimen pour orienter le côté sensoriel de la surface des cellules capillaire vers le haut et coupez le reste de la capsule osseuse et de la paroi latérale. Ensuite, utilisez des forceps pour enlever la membrane tectoriale pour séparer complètement la région moyenne et enlever la capsule osseuse, le tissu latéral de la paroi, et les régions tectoriales des virages restants comme vient de le démontrer. Lorsque tous les virages cochléaires ont été disséqués, répartir 0,5 microlitres d’adhésif cellulaire et tissulaire sur le centre d’un couvercle rond de 10 millimètres et laisser sécher l’adhésif pendant trois à cinq minutes à température ambiante.
Placez les coverslips séchés dans la boîte de Petri et collez les quatre morceaux de chaque échantillon sensoriel d’épithélium sur un seul coverslip. Ensuite, utilisez des forceps pour saisir un bord de chaque coverslip pour transférer les spécimens dans les puits individuels d’un plat de culture cellulaire de quatre puits pour l’immunolabeling. Pour l’immunolabeling des préparations cochléaires de synapse de surface, lavez chaque épithélium sensoriel trois fois pendant cinq minutes dans le PBS frais par lavage, suivi du traitement de chaque échantillon avec deux millilitres de surfactant non ionique de 2% pendant 30 minutes à température ambiante sur un rotateur.
À la fin de l’incubation, aspirer la solution surfactant de chaque puits et bloquer toute liaison non spécifique avec 100 microlitres de solution de blocage par puits pendant une heure sur le rotateur avec une agitation douce à température ambiante. À la fin de l’incubation de blocage, lavez les échantillons trois fois avec du PBS tel que démontré sous une agitation douce avant d’étiqueter chaque épithélium de 100 microlitres des anticorps primaires d’intérêt pendant 24 heures à 37 degrés Celsius protégés de la lumière. Le lendemain, lavez les échantillons trois fois avec du PBS frais et de l’agitation douce par lavage et étiquetez les spécimens avec 100 microlitres des anticorps secondaires appropriés d’intérêt pendant deux heures à 37 degrés Celsius protégés de la lumière.
À la fin de l’incubation, lavez les échantillons avec trois lavages de cinq minutes en PBS frais par lavage avant de placer chaque coverslip sur des diapositives individuelles au microscope en verre avec les échantillons orientés vers le haut. Ensuite, ajoutez soigneusement huit microlitres d’un milieu de montage approprié au centre de chaque coverslip et utilisez des forceps pour monter un autre coverslip de 10 millimètres sur chaque échantillon. Ensuite, sceller les côtés de chaque sandwich coverslip avec du vernis à ongles clair, placer les échantillons dans un dossier de diapositives en carton, et stocker les diapositives à quatre degrés Celsius.
Bien que la dissection de cochlée de souris adulte pour les préparations de surface n’est pas simple, les chercheurs nouveaux à la technique devraient être en mesure d’apprendre la méthode après la pratique avec 10 à 15 oreilles. L’immunolabeling des préparations de surface des souris CBAJ non traitées de 10 à 12 semaines avec CTBP2 et GluA2 démontre que les rubans présynaptiques et les terminaux postsynaptiques respectivement sont situés sous les noyaux intérieurs de cellules capillaires et sont juxtaposés indiquant des synapses fonctionnelles. L’immunolabeling pour la myosine 7A et le contre-coloration avec la phalloidine et le DAPI indique la présence des cellules sensorielles de cheveux comprenant les cellules externes de cheveux et les cellules intérieures de cheveux et leurs noyaux.
L’immunolabeling pour la myosine 7A et le contre-coloration avec la phalloidin ne montrent aucune différence dans l’immunoréactivité ou l’uniformité avec ou sans l’utilisation de l’adhésif de cellules et de tissu. En outre, la microscopie électronique de balayage des préparations de surface des souris noires 6 noires de C57 non traitées de six à huit semaines démontre une stéréocilie en forme de V bien organisée des cellules de cheveux externes dans trois rangées de l’échantillon. N’oubliez pas de remplir le cochléaire avec une solution fixative doucement et lentement à travers les fenêtres rondes et ovales jusqu’à ce que la solution se lave du petit trou à l’apex.
Avant de séparer la région du crochet du virage basal, prenez soin de couper les médialis de la région de crochet pour faciliter l’enlèvement des medialis.
