Ce protocole intègre une approche simple pour rationaliser les étapes de culture, obtenir des explants de haute qualité et contribuera à l’exploration et au dévoilement des mécanismes moléculaires des cellules cochléaires. Le principal avantage de cette technique est une manipulation directe minimale des organes en coordonnant les étapes de dissection, un revêtement de surface polymère approprié, un volume moyen optimisé et un temps de fixation des explants. Cette technique représente une approche in vitro populaire pour étudier la perte auditive neurosensorielle.
Cela peut être utilisé pour établir des modèles ototoxiques, effectuer des analyses structurelles, évaluer les voies de signalisation et mener des études de dépistage de médicaments. En principe, cette méthode peut s’appliquer à différents explants de tissus. Il peut également être utilisé dans la recherche sur l’oreille interne pour mieux comprendre les stades de développement embryonnaires.
Pour commencer, placez la tête du rat décapité sur le tampon stérile. Utilisez des ciseaux et des pinces pour retirer la mandibule, puis soulevez la peau et décollez-la du crâne. Placez la pince dans les cavités orbitaires pour maintenir le crâne.
À l’aide d’une lame de scalpel tranchante, coupez soigneusement le crâne le long de la suture sagittale, puis de la zone de suture coronale sans endommager la cochlée. Maintenant, retirez le cerveau des deux moitiés du crâne. Au microscope, localisez la cochlée dans l’os temporal et relâchez le tissu environnant entre la cochlée et l’os temporal.
Placez ensuite la pince dans le canal semi-circulaire supérieur. Retirez doucement l’os temporal de la cochlée et maintenez la cochlée attachée au vestibule avec l’os temporal. Insérez les pointes de la pince dans la région de l’apex qui est visible sous la forme d’une ligne blanche, et retirez la capsule cochléaire cartilagineuse morceau par morceau pour exposer le canal cochléaire.
Placez les pinces sous la cochlée et détachez-les de l’organe vestibulaire et de l’os temporal. Transférez la cochlée dans une nouvelle boîte de 60 millimètres contenant du PBS glacé. Pour isoler les organes explant de Corti, maintenez l’organe à la base et le canal cochléaire dans la région du crochet basal, et déroulez doucement le canal cochléaire du modiolus sans le déchirer.
Tenez ensuite le canal cochléaire à la base et retirez le ligament spiral et la strie vasculaire. Pour isoler les explants cochléaires, utilisez une pince pour détacher le ganglion spiral de la lame spirale osseuse et déroulez le modiolus pendant le décollement. À l’aide d’une pince, saisissez la région du crochet et retirez le ligament spiral avec la strie vasculaire.
De plus, retirez la membrane de Reissner pièce par pièce. Pour transférer les explants cochléaires, trempez une spatule de laboratoire dans le récipient contenant l’explant. Soulevez l’explant avec les cellules ciliées vers le haut avec quelques microlitres de PBS en agitant une spatule.
Placez l’explant dans une glissière de chambre à huit puits en agitant doucement la spatule dans le milieu. Laissez l’explant glisser dans la chambre. À l’aide d’une pipette de 100 microlitres, retirez 80 microlitres de milieu et jetez-le.
Vérifiez la visibilité des cellules ciliées et des cellules neuronales ganglionnaires spiralées au microscope. Si nécessaire, utilisez une pince pour écarter les tissus qui se chevauchent. Retirez le milieu restant du puits.
L’explant reposera maintenant à plat sur la surface de la chambre. Au bout de 10 secondes, pipetez une ou deux gouttes du milieu juste à côté de l’explant, et le milieu restant à une certaine distance pour éviter le décollement de l’explant. Assurez-vous que les explants ne bougent pas lors de l’ajout du milieu.
Incubez la chambre pendant deux heures pour fixer fermement les organes au fond de la chambre. Après incubation, aspirer le milieu. Et à l’aide d’une pipette de 100 ou 200 microlitres, ajoutez délicatement 300 microlitres de milieu complet frais et préchauffé.
Les images microscopiques confocales du disque rotatif ont montré que les explants de l’organe de Corti chez le rat conservaient leur structure et leur longueur totale dans des conditions normales et stressées. De plus, un microscope confocal à balayage a mis en évidence la survie des cellules ciliées d’explants des organes de souris ainsi que des cellules ciliées subissant une apoptose. Le protocole a permis de surveiller les processeurs biologiques dans les cellules cochléaires vivantes à l’aide de sondes perméables aux cellules appropriées et d’un microscope confocal à disque rotatif.
La culture de ces explants cochléaires améliore l’analyse de l’interaction entre les cellules ciliées et les cellules ganglionnaires spirales. Les cellules ciliées des implants cochléaires ont été détectées à l’aide du marqueur des cellules ciliées, MYO7A. De même, les corps cellulaires ganglionnaires spiralés et les neurites sains et endommagés ont été identifiés à l’aide du marqueur neuronal, Tuj 1.
Dans la vue d’ensemble agrandie, les corps cellulaires des cellules ciliées marquées avec l’anticorps MYO7A étaient visibles. Des stéréocils externes de cellules ciliées et des images déconvolutées de stéréocils de cellules ciliées internes individuelles marquées à la phalloïdine ont été identifiées. Des précautions doivent être prises pendant les procédures au microscope, en particulier lors de la séparation du ganglion spiral de la lame spirale osseuse.
Les explants intacts doivent être transférés et alignés avec soin. Ce protocole a permis d’optimiser les études in vitro sur les explants de l’oreille interne. Les résultats de ces études, tels que les voies de signalisation et la toxicité des médicaments, peuvent guider la conception d’autres études in vivo.
