Il s’agit d’un protocole simple pour la synthèse de nanoamas photoluminescents photoluminescents fonctionnalisables et proche infrarouges et leur détection à l’aide d’une configuration commerciale. Un des principaux avantages de cette technique est que l’attachement du ligand thiol-fonctionnalisé et le couplage du ligand amine-fonctionnalisé sur la surface des nanoamas d’or n’affecte pas défavorablement les propriétés photoluminescentes et la stabilité de bobine. On peut envisager que la combinaison de propriétés intenses de photoluminescence et de conjugaison avec des biomolécules permettra la détection in vitro d’anilides à faible concentration, de biocapsage, de solubling et de bio-imagerie.
Klaudia Kvakova, ma doctorante, démontrera la procédure. La cytométrie du débit sera démontrée par l’assistante de recherche Alzbeta Magdolenova. La partie microscopique sera démontrée par Vaclav Bocan, un étudiant diplômé du laboratoire Lenka Libusova.
Commencez par ajouter 7,8 milligrammes d’acide thioctic dans 60 microlitres d’hydroxyde de sodium bi molaire à 23,4 millilitres d’eau ultrapure et en remuant le mélange jusqu’à dissolution complète. Ajouter ensuite 10,2 microlitres de tétraloraurate d’hydrogène à la solution et, après 15 minutes, ajouter 480 microlitres de borohydride de sodium fraîchement préparé tout en remuant vigoureusement. Continuer à remuer le mélange de réaction pendant la nuit.
Le lendemain, purifier la solution à l’aide de trois cycles d’ultrafiltration avec une coupure de poids moléculaire de trois kilodaltons, puis ajouter 15,6 milligrammes de polyéthylène glycol thiol-terminé à la solution, ajuster le pH entre 7 et 7,5, et remuer le mélange pendant la nuit pour obtenir nanocluster 1. Le lendemain, répétez les trois cycles de centrifugation et de filtration pour purifier la dispersion. Mélanger la solution nanocluster 1 avec le TPP, puis ajuster le pH à 4,5 avec du chlorure d’hydrogène uni molaire.
Commencez la réaction en ajoutant un excès de HCL EDC et surveillez le pH du mélange pendant la première heure. Si le pH dépasse six, réduisez-le en ajoutant du chlorure d’hydrogène. Remuer le mélange de réaction pendant la nuit à température ambiante.
Le lendemain, effectuer trois cycles de centrifugation et de filtration comme décrit précédemment pour obtenir nanocluster 2. Diluer 2 avec de l’eau ultrapure à un volume de 24 millilitres. Ensemencer les cellules dans une plaque de 12 puits à une densité de 20 000 cellules par puits.
Incubez-les pendant 48 heures, puis aspirez le milieu et ajoutez 400 microlitres de milieu de culture complet avec ou sans 500 microgrammes de nanoparticules par puits. Retournez les cellules à l’incubateur de 37 degrés Celsius pour l’internalisation nanocluster. Après deux heures, détachez les cellules avec la trypsinisation standard.
Collectez-les dans des tubes de microcentrifugeuse en polypropylène et une centrifugeuse pendant cinq minutes à 350 fois g et quatre degrés Celsius. Préparez le tampon FCM selon les instructions manuscrites et utilisez un millilitre du tampon pour laver les granulés cellulaires. Centrifugez les cellules pendant encore cinq minutes, puis réutilisez-les dans 500 microlitres du tampon FCM et stockez-les à quatre degrés Celsius.
Avant l’acquisition de l’échantillon, assurez-vous que l’instrument a la configuration optique correspondante. Placez le filtre 780 sur 60 bandpass devant le détecteur 405A. Filtrer tous les échantillons à l’aide d’un tube à fond rond en polystyrène de cinq millilitres avec un bouchon de passoire cellulaire.
Spécifiez la configuration du cytomètre. Tracez une parcelle à points à deux paramètres du FSC-A et du SSC-A pour montrer la distribution des cellules. Pour exclure les doublets, créez une parcelle à points à deux paramètres de FSC-H contre FSC-A et tracez un histogramme à paramètres unique pour la zone du canal fluorescent afin de surveiller l’intensité relative de fluorescence de l’échantillon.
Acquérir un échantillon non traité à un faible débit afin de minimiser les événements coïncidents. Lors de l’acquisition, ajuster les tensions pmt pour obtenir la population non traitée sur l’échelle sur la parcelle FSC par rapport à SSC. Si nécessaire, ajustez les tensions pmt pour le canal FL pour placer la population non tachée sur le coin gauche de l’histogramme.
Sélectionnez ensuite l’onglet Gate spécifique dans le logiciel et dessinez une porte appropriée autour de la population désirée. Les cellules à l’intérieur de la porte se déplaceront vers le prochain point de contrôle. Configurez l’expérience et enregistrez les données.
À 24 heures après l’ensemencement, ajouter 100 microgrammes de 2 à chaque chambre à vaisselle contenant 0,5 millilitres de milieu avec des cellules HeLa. Retourner le plat à l’incubateur et permettre aux cellules d’intérioriser les nanoamas, puis jeter le milieu et laver les cellules avec préchawarmed, milieu frais. Remplissez chaque chambre de 800 microlitres de milieu frais et procédez à l’imagerie.
Pour imager les cellules, utilisez un microscope confocal avec Plan-APOCHROMAT et une lentille objectif huile 63x. Monter le plat sur la scène inversée avec la chambre réchauffée jusqu’à 37 degrés Celsius et fourni avec une atmosphère humidifiée, 5% de dioxyde de carbone. Détecter les nanoamas d’or intériorisés à l’aide d’un laser de 405 nanomètres réglé à 2 % de puissance avec un séparateur de faisceau approprié, en fixant la plage de longueurs d’onde de détection entre 650 et 760 nanomètres.
Réglez la résolution de l’image à 2048 par 2048 pixels. Dans le réglage de la vitesse d’acquisition, visez un temps de vie pixel autour de quatre microsecondes et d’acquérir l’image avec deux fois la moyenne, puis réglez le sténopé à une unité de zone et, pour une sensibilité plus élevée, utilisez le mode de comptage photon. Pour un éclairage correct et une lumière transmise avec DIC, utilisez le réglage par Kohler du condenseur et de l’arrêt sur le terrain.
Pour acquérir la lumière transmise, utilisez un laser de 488 nanomètres à 0,7 % de puissance sans aucun détecteur de fluorescence assigné, en vous assurant de régler un séparateur de faisceau approprié pour la longueur d’onde laser. Les spectres d’absorption ont indiqué que les nanoamas d’or 1 et 2 n’ont pas de bande de plasmon de surface caractéristique et montrent une large émission de 550 à 850 nanomètres. La photoluminescence a fortement augmenté après l’attachement du TPP à la surface de 1.
L’émission des nanoamas était également visible sous une lumière UV de 365 nanomètres. L’émission était stable et sa longueur d’onde était indépendante de la longueur d’onde d’excitation, mais l’intensité était maximale lorsqu’elle était excitée par la lumière UV. La cytométrie d’écoulement a été employée pour confirmer l’absorption de nanocluster 2 par des cellules d’HeLa.
La quasi-fluorescence dépendait à la fois du temps d’incubation et de la concentration du nanoclusteur 2. Les nanoamas d’or dans les cellules ont été photographiés non invasivement avec un microscope à balayage laser confocal standard. Les cellules ont été tachées de nanocluster 2 et, après 24 heures d’incubation, la photoluminescence rouge vif a été observée à l’intérieur des cellules.
Lorsque l’on tente ce protocole, il est important de se rappeler que l’élimination du borohydride de sodium non réagi et hydrolysé est très importante, sinon le polyéthylène glycol thiolé ne se liera pas à la surface du nanoamas d’or. En outre, la photoluminescence des nanoamas d’or commence à partir de 560 nanomètres. Pour éviter l’autofluorescence de fond dans les expériences de microscopie confoccale, les photons doivent être recueillis au-dessus de 650 nanomètres.
