Les SNX-BARs sont des protéines remodelant la membrane qui jouent un rôle clé dans les maladies humaines. En utilisant nos méthodes, nous pouvons déterminer leurs propriétés biophysiques précises pour faciliter la liaison lipidique et le remodelage de la membrane. La purification des protéines SNB-BAR à partir de cellules de levure permet l’acquisition de dimers homo et hétéro SNX-BAR indigènes tout en minimisant la toxicité et l’insolubilité fréquemment rencontrées avec les systèmes d’expression non indigènes.
Nos méthodes peuvent être utilisées pour comprendre les spécificités lipidiques de toutes les levures SNX-BARs ou pour produire des protéines SNX-BAR recombinantes de tout autre organisme. Un assemblage d’extrextruge correct est essentiel pour prévenir la perte de liposome pendant le processus d’extrusion. Pour les étudiants débutants ou ceux qui sont nouveaux sur le terrain, l’observation visuelle des étapes les plus critiques améliorera considérablement vos chances de succès.
Commencez par inoculer un grand écouvillon de cellules de levure dans un flacon au moins quatre fois le volume de la culture contenant 50 millilitres de milieu YP standard complété par 2%raffinose et 0,1% glucose comme source de carbone et de cultiver la culture pendant la nuit dans un shaker de 30 degrés Celsius. Le lendemain matin, inoculer la pré-culture de 50 millilitres dans un litre de médium YP standard avec 2% raffinose et 0,1% glucose dans un volume de 2,8 litres déconcerté flacon Fernbach pour une culture de quatre à cinq heures dans l’incubateur secouant. Lorsque la densité optique à 600 nanomètres atteint 0,2, ajouter la galactose à une concentration finale de 2% aux cellules pour une culture nocturne dans l’incubateur secouant.
Le lendemain matin, récoltez les cellules par centrifugation et transférez la pastille de levure dans un tube conique de 50 millilitres. Resuspendez la pastille en 15 millilitres de tampon de purification pour atteindre un volume final d’environ 30 millilitres et charger la suspension cellulaire sur un homogénéisateur refroidi à quatre degrés Celsius. Lyse les échantillons à 20 à 25.000 livres par pouce carré pendant deux à trois tours et transférer le lysate dans un nouveau tube conique de 50 millilitres sur la glace.
Dégagez immédiatement la cellule lysate par centrifugation et transférez soigneusement le supernatant dans un nouveau tube. Ensuite, équilibrer 300 microlitres de perles IgG Sepharose avec trois re-suspensions dans le tampon de purification avant d’ajouter les perles à la cellule défrichée lysate pour une incubation de deux heures avec rotation à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, ajouter les perles à une colonne de chromatographie de 10 millilitres et laisser passer le lysate non lié.
Lavez les perles 10 fois avec un millilitre de tampon de lavage par lavage permettant à chaque lavage de circuler complètement avant d’ajouter le volume suivant. Après le dernier lavage, utiliser une pipette et tampon frais pour transférer les perles dans un tube de microcentrifugeuse. Porter le volume total des perles à 500 microlitres avec tampon de lavage frais et enlever les perles du lysate avec deux microlitres de 10 milligrammes par millilitre de protéase TEV pour une incubation d’une nuit avec rotation à quatre degrés Celsius.
Le lendemain matin, utilisez une aiguille de calibre 27 pour enlever complètement le surnatant et évaluer la pureté des protéines de 10 % de la page SDS en polyacrylamide. Ensuite, quantifier les protéines concentrées à l’aide de l’analyse des protéines Bradford selon les protocoles standard et stocker la protéine jusqu’à une semaine à quatre degrés Celsius. Pour préparer les liposomes, utilisez des seringues en verre pour transférer les lipides de stock dans un tube propre de culture de verre pour réaliser un mélange final de lipide de 1%phosphatidylinositol-3-phosphate, 20%ergosterol, 30%phosphatidylserine, phosphatidylcholine comme décrit dans le tableau.
Selon les solvants dans lequel chaque lipide est réutilisé, le mélange peut devenir trouble à l’ajout de chaque lipide. Séchez soigneusement les mélanges lipidiques en dirigeant le gaz azoté à faible débit vers les mélanges dans un mouvement circulaire pour traiter les lipides uniformément au fond du tube de verre. Enveloppez ensuite le tube de culture de verre avec du papier d’aluminium laissant l’ouverture découverte et déshydratez davantage les lipides dans le vide pendant une heure.
À la fin de l’incubation, ajouter 400 microlitres de tampon liant à chaque flacon pour réhydrater complètement les lipides à une concentration finale de liposome de 2,5 millimolaire avant de résusquer les lipides à vitesse moyenne sur un vortex à température ambiante pendant 30 minutes. Le tampon doit devenir trouble à mesure que les lipides sont résuspendus. Transférer les liposomes résuspendus dans un tube de microcentrifugeuse et congeler les tubes dans de l’azote liquide, puis décongeler dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius sept à huit fois.
Dans une hotte de fumée chimique, nettoyez deux seringues en verre d’un millilitre avec un volume complet de chloroforme trois fois par seringue pour éliminer les lipides résiduels et équilibrer chaque seringue avec deux volumes d’eau ultrapure et deux volumes de tampon liant. Assembler un mini-extruder selon les recommandations du fabricant. Puis submergez deux morceaux de support de filtre dans une membrane de 200 nanomètres dans le tampon de liaison.
Il est important d’assembler le mini-extruder de sorte qu’il soit complètement hermétique. Et une bonne façon de vérifier les fuites est de passer tampon à travers l’appareil. Sandwich de la membrane entre les supports de filtre et placez la membrane dans le mini-extrème.
À l’aide d’une des seringues d’un millilitre équilibrées, passez un volume de tampon liant semblable au volume du mélange liposome à travers le mini-extrème et utilisez l’autre seringue pour laisser tomber le mélange liposome inversant le tube de microcentrifugeuse pour recueillir le dernier des liposomes dans le bouchon de tube pour leur collection. Puis extruder les liposomes à travers la membrane de 200 nanomètres 19 à 21 fois et de recueillir les liposomes extrudés dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. Avant d’effectuer les analyses de fixation et de tubulation liposome SNX-BAR, pré-effacer la protéine purifiée par ultracentrifugation et transférer le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse sans déranger la pastille.
Ensuite, incuber quatre micromolaires de SNX4-ATG20 purifié et 2,5 millimolaires de liposomes dans un volume de réaction total de 20 microlitres pour une incubation de 30 minutes à 30 degrés Celsius. Pour visualiser et quantifier la tubulation liposome, à la fin de l’incubation, placez immédiatement les échantillons sur une grille en maille de cuivre recouverte de carbone et une tache négative avec 1 % d’acétate d’uranyle. Ensuite, analyser les échantillons sur un microscope électronique de transmission à 200 kilovolts.
Pour la liaison et la sédimentation liposome, transférer 20 microlitres de la réaction à un tube de centrifugeuse en polycarbonate et faire tourner l’échantillon avec un routeur compatible dans une ultracentrifugeuse. À la fin de la centrifugation, transférez soigneusement le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse et réutilisez la pastille dans 40 microlitres de tampon d’échantillon de page SDS. Transférer la suspension à granulés dans un nouveau tube de microcentrifugeuse et ajouter 20 microlitres de tampon d’échantillon au supernatant.
Chargez ensuite des volumes équivalents d’échantillons de granulés et de supernatants sur un gel de page SDS à 10 % de polyacrylamide et effectuez la coloration Coomassie pour visualiser les SNX-BARs liés aux liposomes. Pour vérifier l’induction appropriée de l’expression SNX-BAR, une tache occidentale contre l’étiquette de purification d’affinité de tandem peut être employée car les niveaux de protéine des SNX-BARs peuvent ne pas être détectés par l’intermédiaire de la tache de Coomassie. Après la purification de l’heterodimer SNX-BAR, les bandes des deux SNX-BARs devraient apparaître dans un rapport stoichiométrique un-à-un et il devrait y avoir peu ou pas de bandes contaminantes.
Dans cette analyse représentative, des heterodimers de SNX-BAR ont été exprimés, purifiés, et liés aux liposomes synthétiques comme démontré. Notez que MVP1 formé homodimers et a été exprimé en bactéries comme prévu. La liaison SNX-BAR à différentes compositions liposome pourrait être quantifiée par densitométrie pour évaluer les effets de la phosphatidylserine par exemple sur la liaison liposome.
L’imagerie par microscopie électronique permet de mesurer les tubules liposome SNX4-ATG20, la plupart des tubules ayant généralement un diamètre compris entre 14 et 26 nanomètres. Notez que les SNX-BARs purifiés peuvent être reconstitués avec des complexes de capture de cargaison sur des liposomes pour comprendre comment les assemblages complets peuvent influencer le remodelage de membrane. En comparant la liaison de différentes combinaisons de dimers purifiés de SNX-BAR aux liposomes synthétiques composés de différents lipides, les protéines de SNX-BAR se sont trouvées pour posséder des préférences distinctes de liaison de lipide.
Travaillez toujours dans une hotte lors de la manipulation du chloroforme et assurez-vous de porter le PPE approprié lors de la manipulation des objets tranchants ou des matériaux en verre.
