Nous remercions tous les membres du laboratoire Kerscher pour leur soutien. Nous remercions Mark Hochstrasser pour la souche de levure MHY3765. Ce travail a été soutenu par la NSF subvention 1051970 (OK) et Hughes Medical Institute cycle de subvention de voyage Howard et Monroe Scholars Programme de subventions (pour ES).

Purification des protéines marquée à la 6XHis exprimés dans les cellules de levure en herbe dans des conditions natives 1. La croissance des cellules de levure et l&#39;induction de l&#39;expression des protéines (Modification de 2) OPTION: Utilisez croissance logarithmique des cultures de levures exprimant la protéine d&#39;intérêt à la place des cultures galactose induits décrits ci-dessous. <ol><li> Transformer des cellules d&#39;une souche de levure Gal + avec un plasmide codant pour un inductible par le galactose 6xHIS protéine marquée de choix. Par exemple, voir la liste des réactifs. </li><li> Inoculer transformants dans 5 ml de milieux sélectifs appropriés (p. ex SD-uracile) contenant 2% de saccharose. Incuber à 30 ° CO / N, tournant. </li><li> Diluer O / N culture de telle sorte que la densité optique à 600 nm mesure 0,3 (DO600 = 0,3) dans 33 ml de milieu sélectif avec 2% de saccharose. Croître à 30 ° C, agitation (Δ150 rpm). </li><li> Lorsque la culture a atteint DO600 = 0,8-1,5, Induire l&#39;expression de la protéine désirée par l&#39;addition de 17 ml de YEP 3x avec 6% de galactose (recette dans le tableau 1), pour une concentration finale de 1 x YEP avec 2% de galactose. Volume de culture totale est maintenant de 50 ml. Incuber, secouer, à 30 ° C pour un 5-6 heures supplémentaires. Remarque: le volume de culture peut être modifiée. Dans l&#39;étape 1.3, dilué dans les deux tiers du volume final désiré. Dans l&#39;étape 1.4, ajouter un tiers le volume final de 3x YEP / 6% de galactose. </li><li> Mesurer la DO 600 de la culture induite et centrifuger Δ150-200 OD 600 unités de cellules pendant 5 min à 5000 rpm à 4 ° C. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire avec 1 ml glacée 1x PBS avec 1x protéase cocktail d&#39;inhibiteur et le transfert dans un tube à bouchon à vis 2 ml. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 1 min à 15000 rpm à 4 ° C. Décanter le surnageant. </li><li> Enclencher cellule gel culot dans de l&#39;azote liquide, suivie d&#39;une lyse immédiate des cellules ou du stockage à -80 ° C jusqu&#39;à l&#39;utilisation. </li></ol><ol><li> Pour le culot de cellules congelées en provenance de l&#39;étape précédente, ajouter 200 ul de billes de verre lavées à l&#39;acide et 500 pi de tampon de lyse glacé (recette dans le tableau 1 ou utiliser un tampon de lyse cellulaire de choix). </li><li> Brièvement pipette de haut en bas. Il n&#39;est pas nécessaire de remettre en suspension entièrement le culot cellulaire. Garder les tubes sur la glace en tout temps. Note: La fin de la pointe de la pipette peut être coupée avant le pipetage de haut en bas. </li><li> À 4 ° C, le lieu le tube (s) avec des cellules dans le broyeur à billes, d&#39;équilibre, de verrouillage, et faire fonctionner la machine selon les instructions du fabricant. </li><li> Exécutez le batteur perles contenant le tube (s) de 20 sec à 5,5 m / sec, puis placer sur la glace fondante pendant 1 min. Répétez 6x au total. </li><li> Effacer les protéines extraites par centrifugation pendant 15 min à 15000 rpm à 4 ° C. OPTION: enlever les petites particules par centrifugation à travers un filtre SpinX. </li><li> Préparer un échantillon de la cellule entière eXTRACT (WCE) pour confirmer la présence de la protéine d&#39;intérêt par Western Blot: <ol><li> Ajouter WCE correspondant à 2 OD 600 unités de cellules (par exemple 5 ul d&#39;extrait effacé si 200 OD 600 unités de cellules ont été récoltées) à 800 ul 20% d&#39;acide trichloracétique (TCA). Vortex pour mélanger. </li><li> Centrifuger pendant 2,5 min à 15000 rpm à 4 ° C. Décanter le surnageant, mais attention à conserver le culot. </li><li> Ajouter 800 ul de 2% de TCA à la pastille et le tube vortex, suivie d&#39;une centrifugation pendant 2,5 min à 15000 rpm à 4 ° C. Décanter le surnageant, mais attention à conserver le culot. </li><li> Ajouter 100 ul de TCA tampon d&#39;échantillon (recette dans le tableau 1), vortex pour dissoudre granulés. Remarque: Si la mémoire tampon de l&#39;échantillon devient acide (vire au jaune) après addition de la pastille, ajouter des aliquotes de Δ10 pi de Tris base [1M] jusqu&#39;à ce que l&#39;échantillon est de nouveau bleu. </li><li> Incuber dans un bloc chauffant ° 100 ° C pendant 2-5 min. </li><li> Vortex again de dissoudre complètement si des restes de granulés sont toujours présents. Pastilles préparées par cette méthode sont notoirement difficiles à dissoudre complètement. Il peut prendre Δ10 min de vortex pour dissoudre complètement pellets. </li><li> échantillon de magasin à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li></ol></li><li> Enclenchez geler portions de rester WCE autorisé dans de l&#39;azote liquide et conserver à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li></ol> 3. Purification des lots de protéines de cellule de levure homogénats Note: Cette méthode de purification a été optimisé pour la purification des protéines 6xHIS-clé le Co 2 + résine d&#39;affinité métallique. <ol><li> L&#39;équilibrage de la résine <ol><li> Pour un échantillon de WCE dégagé préparé à partir Δ20-40 OD 600 unités de cellules, ajouter 50-100 ul de résine d&#39;affinité à un tube à centrifuger. Les protéines extraites des cellules qui n&#39;expriment pas la protéine désirée ou une résine non-spécifique, telles que l&#39;amylose, peuvent être utilisés en tant que commandes pour la liaison non spécifique. </li><li> Lavez résine 5x avec 1 ml de tampon de lavage: inverti haut-over-bas jusqu&#39;à ce que la résine est remis en suspension, puis tourner pendant 1 min à 5000 rpm à 4 ° C. Aspirer le surnageant. Remarque: si vous effectuez l&#39;extraction et la purification, le même jour, l&#39;équilibrage de la résine peut être effectuée avant l&#39;extraction. </li></ol></li><li> La liaison aux protéines pour la purification par affinité <ol><li> Ajouter 100-200 pi de lysat clarifié (Δ20-40 OD 600 unités) à 50-100 ul billes lavées, et porter le volume total de 1 ml avec le tampon de lyse. </li><li> Incuber avec nutation ou bascule à 4 ° C pendant 2-5 heures. </li><li> Faites tourner pendant 1 min à 5000 rpm à 4 ° C. </li><li> Si l&#39;on désire mettre un échantillon du surnageant restant pour l&#39;analyse ultérieure des protéines non fixées. TCA précipiter comme détaillé ci-dessus pour la WCE (étape 2.6). </li><li> Lavez résine avec protéines liées 5x avec 1 ml de tampon de lavage, suivi d&#39;une vrille pendant 1 min à 5000 rpm à4 ° C. Conserver les échantillons froid pendant lavages. </li></ol></li><li> L&#39;élution des protéines liées <ol><li> Ajouter 150 ul de tampon d&#39;élution de la résine, nutation à 4 ° C pendant 5 min, rotation pendant 1 min à 5000 rpm à 4 ° C et conserver le surnageant dans un nouveau tube. OPTION: Répéter 2x et élutions de la piscine. </li><li> Préparer échantillon élué pour le Western Blot: Pour 25 pi de protéines éluées, ajouter 25 ul 2x dodécylsulfate de lithium (LDS) de tampon d&#39;échantillon avec 2 pi β-mercaptoéthanol (BME) et incuber dans une ° C bloc 100 de la chaleur pendant 2 min. Remarque: le tampon d&#39;échantillon Laemmli 2X standard peut également être utilisé. </li><li> Enclenchez gel excès de protéine éluée dans l&#39;azote liquide. OPTION: protéines restantes bande de résine avec un volume égal de tampon d&#39;échantillon LDS 2x à 65 ° C pendant 5 min, retirer les protéines LDS-élues dans un nouveau tube, puis ajouter 2 BME ul aux protéines éluées, pas à la résine. Cet ordre est d&#39;empêcher le retrait de tous les ions ou des anticorps qui sont ConjugaTED pour les perles. </li><li> Conserver les échantillons à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li></ol></li><li> Western Blot et la sonde avec des anticorps appropriés pour visualiser les protéines. <ol><li> Chargez 10-20 ul (Δ1-3 OD 600 unités) de chaque échantillon et 3-10 ul d&#39;une échelle de protéines dans un gel SDS-PAGE de choix. Gels couramment utilisés pour ce protocole comprennent 4-12% Bis-Tris et 8% Tris-Glycine. </li><li> Exécuter gel à 200 V pendant 50 min. </li><li> Le transfert des protéines à partir de gel sur une membrane de PVDF par transfert semi-sec à 19 V pendant 20 à 30 min (recette dans le tableau 1). </li><li> membrane de bloc dans 4% milk/1x solution saline tamponnée au Tris-Tween (TBST) pendant 1 heure à température ambiante ou O / N à 4 ° C (recette dans le tableau 1). </li><li> Incuber la membrane avec l&#39;anticorps primaire de la protéine à marquage épitopique d&#39;intérêt à 4% milk/1x TBST pour 1-3 heures à température ambiante ou O / N à 4 ° C. </li><li> Lavez membrane 3x pendant 5 min chacun avec TBST 1x. </li><li> Incuber avec membrane appropriéeperoxydase de raifort secondaire (HRP) anticorps conjugué pendant 1-3 heures à température ambiante. </li><li> Lavez membrane 3x pendant 15 min chacun dans un grand volume d&#39;TBST 1x. </li><li> Couvrir avec membrane substrat ECL et l&#39;envelopper dans une pellicule transparente. </li><li> Exposer la membrane de filmer et de développer de visualiser des protéines. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+construction+inSaccharomyces+cerevisiae.">Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).</li><li>Gelperin, D. M., White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection.">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).</li><li>Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+and+In+Vitro+Analyses+of+Regulation+of+the+Pheromone-Responsive+prgQ+Promoter+by+the+PrgX+Pheromone+Receptor+Protein.">In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein.</a> J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).</li><li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast.">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li><li>Hannich, J. T., Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+SUMO-modified+proteome+by+multiple+approaches+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).</li><li>Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-independent+in+vivo+activity+of+a+SUMO-targeted+ubiquitin+ligase+toward+a+short-lived+transcription+factor.">SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor.</a> Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).</li><li>Daum, G. G., B&#246;hni, P. C. P., Schatz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Cytochrome+b2+and+cytochrome+c+peroxidase+are+located+in+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).</li><li>Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to protein purification. , (1990).</li><li>Puig, O., Caspary, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+Method:+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+125-kd+membrane+glycoprotein+of+Saccharomyces+cerevisiae+is+attached+to+the+lipid+bilayer+through+an+inositol-containing+phospholipid.">A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid.</a> EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).</li><li>Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinity+of+cholera+toxin+for+Ni2++ion.">The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion.</a> Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).</li><li>Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+C-type+cyclin+Ctk2p+is+phosphorylated+and+rapidly+degraded+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).</li><li>Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumo-dependent+substrate+targeting+of+the+SUMO+protease+Ulp1.">Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1.</a> BMC Biol. 9, 74 (2011).</li><li>Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Hex3.Slx8+heterodimer+is+a+ubiquitin+ligase+stimulated+by+substrate+sumoylation.">The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation.</a> J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Ce protocole met l&#39;accent sur la préparation du intact, indigène, et modifications post-traductionnelles des protéines à partir de cellules de levure en herbe pour les applications en aval. Avant de tenter ce protocole, il est essentiel de déterminer si la protéine d&#39;intérêt peut être facilement détectée dans des extraits protéiques préparés dans des conditions dénaturantes 12. Si des anticorps polyclonaux sont pas disponibles, il peut être avantageux d&#39;épitope tag la protéine d&...

La puissance impressionnante de levure génétique est légendaire, mais la préparation et l&#39;analyse des protéines natives de levure bourgeonnante, Saccharomyces cerevisiae, est souvent source de nombreux problèmes. Celle-ci est due à la résistance mécanique importante et l&#39;élasticité de la paroi une cellule de levure. Différents moyens ont été décrits pour la perturbation des cellules de levure pour obtenir un extrait de protéines de cellules entières 2-6 enzymatique, chimique, mécanique, et basée sur la pression. Ces techniques varient considérablement dans leur efficacité à produire des extraits de protéines de cellules représentatives, indigènes qui peuvent être utilisés pour des analyses ultérieures ou des étapes de purification. Par exemple, la paroi cellulaire de la levure peut être retiré avec des enzymes lytiques (par exemple zymolyase) et sphéroblastes résultant peut être perturbé par cisaillement, des détergents, ou lyse osmotique pour libérer des protéines. Cette approche a été utilisée avec succès comme point de départ pour de nombreux fractionnements subcellulaires mais il exige de longues incubationsqui ne sont pas compatibles avec la stabilité de certaines protéines 7. Propriétaires réactifs de lyse de levure (tels que les détergents) pour l&#39;extraction chimique des protéines de cellules de levure sont disponibles dans le commerce, mais l&#39;efficacité de ces réactifs dans l&#39;extraction des protéines et de leurs effets sur la caractérisation biochimique ultérieure des protéines n&#39;est pas toujours clair 8. Homogénéisateurs haute pression, souvent appelés presses françaises, briser efficacement les cellules de levure d&#39;abord en les soumettant à une pression élevée, puis les extruder à travers une petite ouverture dans une cellule de pression. Cette technique produit des extraits de haute qualité, mais le matériel est très coûteux et peut ne pas convenir pour de petites quantités de cellules ou de plusieurs échantillons 9. Par conséquent, une rupture mécanique des cellules de levure dans un broyeur à billes est souvent la méthode de choix pour les préparations de protéines de levure indigène 10. Cette technique implique la rupture mécanique de la paroi cellulaire de la levure avec de l&#39;acide-wajeter des perles de verre, qui peut être réalisé avec une variété de shakers, vortexeurs ou broyeurs à billes. Notamment, cette méthode peut être utilisée pour traiter simultanément plusieurs échantillons plus petits (1 ml de cellules ou moins). De nombreuses perles différentes matrices de perles ou de perturbation de l&#39;usine sont maintenant disponibles commercialement pour perturber presque n&#39;importe quel genre de type de cellule en tubes de 2 ml. Compte tenu des autres techniques et de l&#39;équipement, un broyeur à billes a l&#39;avantage supplémentaire que la perturbation des cellules de levure se produit très rapidement, ce qui contribue à préserver modifications post-traductionnelles telles que la sumoylation, surtout quand les tampons appropriés avec la protéase et / ou inhibiteurs du protéasome sont utilisés et la température d&#39;extraits est contrôlée. Ce protocole porte sur l&#39;extraction rapide, efficace et fiable de protéines endogènes et surexprimé dans des conditions douces avec l&#39;objectif ultime de préserver la fonction des protéines, des interactions et des modifications post-traductionnelles. Les milieux de culture, tampons de lyse cellulairecompositions et les paramètres de broyeur à billes sont optimisés pour maintenir les interactions entre protéines et des modifications post-traductionnelles telles que la sumoylation et l&#39;ubiquitination.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1039">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Omni Bead Ruptor 24</td>
			<td style="width:124px;">Omni International</td>
			<td style="width:119px;">19-010</td>
			<td style="width:580px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast ORF strain in BG1805</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>YSC3869</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pYES2.1 TOPO vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K4150-01</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1860932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3369-3</td>
			<td>Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m (30-40 US sieve)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS8161</td>
			<td>Use for additional filtering of clarified lysate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TALON Metal Affinity Resin</td>
			<td style="width:124px;">Clontech</td>
			<td>635502</td>
			<td>For the purification of 6xHIS tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td>Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Simply Blue</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#LC6060</td>
			<td>Protein gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mammalian Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:119px;">G9381</td>
			<td>Alternative commercial lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-V5 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7345</td>
			<td>Method of immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ECL</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PVDF membrane</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BIS-TRIS gels</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-myc antibody</td>
			<td style="width:124px;">Covance</td>
			<td style="width:119px;">mms-150R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">secondary antibody</td>
			<td style="width:124px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97040</td>
			<td>Goat pAb to mouse IgG (HRP)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications

Homogénéisation en battant perle est un moyen rapide et efficace pour libérer l&#39;ADN, l&#39;ARN, les protéines et les métabolites à partir de cellules de levure en herbe, qui sont notoirement difficiles à perturber. Nous décrivons ici l&#39;utilisation d&#39;un homogénéiseur broyeur à billes pour l&#39;extraction des protéines dans des tampons optimisés pour maintenir les fonctions, les interactions et les modifications post-traductionnelles des protéines. Cellules en croissance logarithmique exprimant la protéine d&#39;intérêt sont cultivées dans un milieu de croissance liquide de choix. Les milieux de culture peuvent être complétées par des réactifs pour induire l&#39;expression de la protéine à partir de promoteurs inductibles (par exemple le galactose), synchroniser stade du cycle cellulaire (par exemple le nocodazole), ou d&#39;inhiber la fonction du protéasome (par exemple MG132). Les cellules sont ensuite culot et remises en suspension dans un tampon approprié contenant la protéase et / ou inhibiteurs de phosphatases et soient traités immédiatement ou congelés dans l&#39;azote liquide pour une utilisation ultérieure. L&#39;homogénéisation est réalisée par six cycles de 20 sec bead-battement (5,5 m / s), chacun suivi d&#39;une incubation d&#39;une minute sur la glace. L&#39;homogénat obtenu est clarifié par centrifugation et les petites particules peut être éliminé par filtration. L&#39;extrait de cellules entières dégagé résultant (WCE) est précipité en utilisant 20% de TCA pour l&#39;analyse directe des protéines totales par SDS-PAGE suivie par Western blot. Extraits sont également appropriés pour la purification par affinité de protéines spécifiques, la détection des modifications post-traductionnelles, ou l&#39;analyse de protéines co-purification. Comme c&#39;est le cas pour la plupart des protocoles de purification des protéines, des enzymes et des protéines peuvent exiger des conditions particulières ou des compositions de tampons pour leur purification et d&#39;autres peuvent être instables ou insoluble dans les conditions indiquées. Dans ce dernier cas, le protocole présenté peut fournir un point de départ utile pour déterminer empiriquement la meilleure stratégie de perles battre pour l&#39;extraction et purification des protéines. Nous montrons l&#39;extraction et la purification d&#39;un épitope étiqueté SUMO E3 ligase, SIZ1, un cycle cellulaireréglage protéine qui devient à la fois sumoylée et phosphorylé, ainsi que d&#39;une sous-unité de l&#39;ubiquitine ligase SUMO ciblée, Slx5.

Nos résultats représentatifs révèlent que le protocole d&#39;extraction de perles coups et protéine décrite est utile pour la préparation reproductible de protéines pour une variété d&#39;applications en aval (résumées dans le tableau 2). SDS-PAGE suivie d&#39;une coloration de Coomassie de ACEE montrent qu&#39;une large gamme de protéines (~ 12 à&gt; 250 kDa) peut être reproductible extrait des cellules de levure (figure 1A). Bandes discrètes sur une gamme de poids mol?...

Watch this Scientific Journal Video about Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications at JoVE.com

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

La préparation d&#39;extraits de levure de haute qualité est une première étape nécessaire à l&#39;analyse des protéines individuelles ou protéomes entiers. Nous décrivons ici un protocole d&#39;homogénéisation rapide, efficace et fiable pour les cellules de levure en herbe qui a été optimisé afin de préserver les fonctions des protéines, des interactions et des modifications post-traductionnelles.

Bourgeonnement de levure extraction et purification des protéines pour l&#39;étude de la fonction, Interactions, et des modifications post-traductionnelles

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

budding-yeast-protein-extraction-purification-for-study-function

Research

JoVE Journal

Biology

24.8K vues.  The College of William & Mary.  La préparation d'extraits de levure de haute qualité est une première étape nécessaire à l'analyse des protéines individuelles ou protéomes entiers. Nous décrivons ici un protocole d'homogénéisation rapide, efficace et fiable pour les cellules de levure en herbe qui a été optimisé afin de préserver les fonctions des protéines, des interactions et des modifications post-traductionnelles. 

Vidéo: Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Mesure Life Span réplicative dans la levure bourgeonnante

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Recherche

Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Analyse du développement d&#39;un phénotype morphologique en fonction de la concentration de protéines dans la levure bourgeonnante

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

Détection des modifications post-traductionnelles sur les autochtones nucléosomes Intact par ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Identification des modifications post-traductionnelles des protéines végétales Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

La combinaison unique molécule manipulation et d&#39;imagerie pour l&#39;étude des interactions protéine-ADN

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

Découvrir interactions des protéines et caractérisation de protéines de fonction utilisant la technologie HaloTag

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Protein Purification Technique qui permet la détection de sumoylation et Ubiquitination de levure bourgeonnante kinétochoriens protéines Ndc10 et Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Flux de travail complet pour l&#39;analyse des histones modifications post-traductionnelles utilisant la spectrométrie de masse Bottom-up: De Histone Extraction à l&#39;analyse des données

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Applications de pHluorin pour Quantitative, Kinetic et à haut débit Analyse des endocytose dans la levure bourgeonnante

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...