Notre protocole est important parce qu’il permet à la fois la dréplication rentable et opportune des antibiotiques connus sans l’utilisation d’équipement spécialisé. Le principal avantage de cette technique est la personnalisation du modèle. Cela signifie qu’un individu peut adapter les gènes de résistance qu’il souhaite inclure dans son modèle de bibliothèque en fonction du niveau souhaité de spécificité du substrat large ou étroit.
Par exemple, un modèle bêta-lactam exprime E.coli peut être préparé afin de permettre la dréplication très spécifique des bêta-lactams et de leurs diverses sous-classes. À l’aide d’une technique septique, pipette 500 microlitres de cation ajusté MHB à partir d’un réservoir stérile dans chaque puits d’une stérile, 96 plaques de puits profonds. Avec les plaques de contrainte ARP ou MARP préparées, utilisez un bâton applicateur pour inoculer la plaque de puits de 96 profondeurs conformément à la carte ARP ou MARP.
Placez une membrane d’étanchéité respirante à la surface de la plaque profonde du puits et incubez-la pendant la nuit à 37 degrés Celsius, 250 rPM. Assurez-vous qu’il n’y a pas de puits contaminés. À l’aide d’une pipette multicanal, transférer 100 microlitres de chaque puits de la plaque de puits profonde vers une plaque inférieure ronde stérile de 96 puits.
Ajouter 100 microlitres de 50% glycérol stérile dans chaque puits et mélanger en pipetting doucement de haut en bas. Préparer au moins cinq assiettes de bibliothèque. Couvrir les plaques de joints d’aluminium stériles et s’assurer que chaque puits est scellé individuellement.
Placez le couvercle de la plaque sur le joint d’aluminium et rangez-le à moins 80 degrés Celsius. À l’aide d’un bâton applicateur en bois, racler délicatement les spores de la surface d’une colonie de streptocoques et les transférer dans un tube à essai contenant une perle de verre stérile et trois millilitres de streptocoque moyen antibiotique. Fermez le tube à essai lâchement avec un bouchon pour permettre l’aération.
À l’aide du même bâton d’applicateur en bois, strier un contrôle de stérilité sur une boîte de Pétri contenant l’agar de Bennett. Incuber le tube contenant la culture des graines à 30 degrés Celsius avec aération pendant six jours à 250 RPM et la plaque de contrôle de la stérilité à 30 degrés Celsius pendant six jours. Ensuite, sur une surface plane, préparer des plaques de dréplication.
Aspirez 23 millilitres d’agar bennett chaud dans une pipette sérologique et distribuez 20 millilitres uniformément à travers la surface d’une boîte rectangulaire de Petri, laissant le reste du milieu dans la pipette pour empêcher la formation de bulle d’air. Couvrir la plaque d’un couvercle. Faites pivoter doucement la plaque jusqu’à ce que le milieu couvre toutes les zones de la plaque et ne la dérangez pas jusqu’à ce que l’agar ait complètement réglé.
Ensuite, préparez des feuilles membranaires de nitrocellulose en utilisant un couvercle rectangulaire de boîte de Petri comme modèle de traçage de sorte que les feuilles s’adaptent à la surface de la plaque de dréplication. Couper les feuilles et les autoclaves dans une poche stérile. Maintenant, vérifiez la plaque de contrôle de la stérilité pour vous assurer qu’aucun contaminant n’est présent après six jours d’incubation.
S’il n’y a pas de contamination, retirer le couvercle de la boîte rectangulaire de Petri et pipette 200 microlitres de la culture des graines à la surface de l’agar bennett dans le plat rectangulaire. Utilisez un coton-tige stérile pour répartir uniformément la culture à la surface de toute la plaque. Pour positionner la membrane de nitrocellulose préparée au-dessus de la culture à la surface de la boîte de Pétri, alignez le bord inférieur de la membrane jusqu’au bord inférieur de la boîte de Pétri et appliquez lentement la membrane du bord inférieur au bord supérieur de la plaque.
Utilisez un coton-tige stérile pour lisser les bulles d’air qui pourraient s’être formées entre l’interface de l’agar membranaire, en veillant à ce que la membrane soit rincée jusqu’à l’agar. La membrane permet aux organismes de sporulate sur sa surface tandis que les métabolites secondaires peuvent être excrétés dans le milieu ci-dessous. Remettre le couvercle sur la boîte rectangulaire petri et le placer à l’envers dans un sac en plastique scellé.
Incuber à 30 degrés Celsius pendant six jours. Après six jours, retirer la plaque de dréplication de l’incubateur. À l’aide d’une pince stérile, retirer soigneusement la membrane de la nitrocellulose de la surface de l’agar bennett.
Assurez-vous qu’il n’y a qu’une croissance mineure des spores sur les bords de la plaque pour réduire les chances de contamination de la superposition à ajouter. Assurez-vous que la surface de travail est de niveau et utilisez une pipette sérologique pour aspirer 23 millilitres d’agar MHB ajusté à la cation chaude. Créer une superposition en distribuant 20 millilitres uniformément à travers la surface de la plaque de dréplication, laissant le reste de l’agar dans la pipette pour empêcher la formation de bulles d’air.
Placez le couvercle sur la plaque. Faites pivoter doucement la plaque jusqu’à ce que le milieu couvre toutes les zones et ne la dérangez pas jusqu’à ce que l’agar ait complètement réglé. Une fois refroidi et solidifié, remettre la plaque de déréplication dans le sac en plastique scellé et le conserver à l’envers à quatre degrés Celsius pendant la nuit, ce qui permet la diffusion de métabolites secondaires dans la superposition d’agar MHB.
Le même jour, inoculer un modèle ARP ou MARP frais en pipetant d’abord 100 microlitres de cation ajustés MHB dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Sortez la plaque de bibliothèque ARP ou MARP congelée du congélateur de moins 80 degrés Celsius. Retirer le joint d’aluminium avant que la condensation ne commence à se former sur sa face inférieure.
À l’aide d’outils stériles d’épinglant 96 puits, épinglez soigneusement la plaque de bibliothèque ARP ou MARP congelée et inoculez le MHB frais contenant des assiettes de 96 puits. Pour minimiser la contamination lors de la dréplication, préparez autant de plaques de bibliothèque ARP ou MARP nécessaires pour ne redépliquer que deux à trois plaques de dréplication par plaque de bibliothèque. Une fois terminé, placez un nouveau joint stérile en aluminium sur le modèle congelé et retournez-le au congélateur de moins 80 degrés Celsius.
Placez les plaques inoculées de 96 puits à l’intérieur d’un sac en plastique lâchement scellé et incubez à 37 degrés Celsius en secouant à 250 rPM pendant 18 heures. Retirez le modèle ARP ou MARP de l’incubateur et assurez-vous qu’aucun contaminant n’est présent en comparant la plaque à la carte modèle ARP ou MARP. Retirer les plaques de déréplication de quatre degrés Celsius et laisser équilibrer à température ambiante.
S’il y a condensation, ouvrez les couvercles et laissez sécher dans un environnement stérile. À l’aide d’outils d’épingnage stériles, épingler de la plaque de bibliothèque ARP ou MARP sur la surface de la superposition d’agar MHB des plaques de dréplication. Veillez à ne pas percer l’agar.
Laissez sécher l’inoculum du modèle pendant trois à cinq minutes. Placer les plaques de déréplication inoculées à l’envers dans un sac en plastique scellé et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, analyser les résultats de la dréplication en comparant la croissance de la plaque de dréplication aux puits qui correspondent à la carte ARP ou MARP.
Dans ce flux de travail de déreplication ARP ou MARP, un résultat de dréplication positif a été obtenu. Dans lequel l’extrait préparé pour la souche WAC 8921 a été identifié comme un producteur de chloramphéniphélique. L’absence de croissance de l’ARP indique la présence d’un antibiotique inconnu ou d’un antibiotique moins communément trouvé qui n’a pas été pris en compte dans la plaque de bibliothèque ARP ou MARP.
Un modèle de croissance unique au MARP a été formé en raison de son utilisation du type sauvage E.coli BW25113 et d’un mutant hyper-perméable et déficient e-flux E.coli BW25113 bamB tolC. Ce résultat suggère la présence d’un composé avec l’activité antimicrobienne qui n’a pas pu dépasser une membrane externe intacte. Ces modèles de croissance d’E.coli suggèrent la stérilisation inappropriée des outils d’épinglant, ayant pour résultat le transfert des souches inconnues d’E.coli à travers la superposition.
Et un exemple de contamination des plaques de bibliothèque congelées ARP ou MARP est montré ici avec trois colonies distinctes d’E.coli cultivées sur la surface rectangulaire de la boîte de Pétri. Ce résultat indique que la superposition d’agar a été percée pendant la dréplication. La contamination liée à la superposition du MHB peut également se produire pendant le processus de redondant, montrant un modèle de croissance irrégulier à la surface de la superposition.
La chose la plus importante à retenir lorsque vous suivez ce protocole est d’utiliser une stérilisation appropriée et des techniques aseptiques afin de s’assurer que vous n’êtes pas retenu dans n’importe quelle étape en raison de la contamination. Cela comprend la préparation de la membrane de nitrocellulose afin qu’elle s’adapte à la surface de la plaque d’agar de Bennett aussi étroitement que possible afin de minimiser la propagation des spores lors de la coulée de la superposition MHB. En outre, il est également extrêmement important d’utiliser l’équipement d’épinginglement correctement stérilisé lors de l’inocculation des plaques de bibliothèque et de la réplication afin de produire le résultat le plus propre.
En plus de redépliquer les antibiotiques connus, cette méthode peut être appliquée à l’identification des adjuvants qui peuvent être utilisés conjointement avec les antibiotiques existants pour sauver leur activité. Bien que la dréplication des antibiotiques ne soit pas une nouvelle technique, elle est connue pour être gourmande en ressources et prendre beaucoup de temps. La plate-forme ARP et MARP aide à faire la lumière sur la façon dont la dréplication des antibiotiques n’a pas besoin d’être une grande production, mais peut plutôt être achevée sur une période de deux semaines en utilisant un minimum d’équipement.
