Cette technique nous permet de mesurer la susceptibilité aux antibiotiques dans des conditions plus cliniquement pertinentes. La technique nous permet également de déterminer la véritable concentration d’antibiotiques qui peut tuer les bactéries dans les agrégats. Cette technique peut être appliquée pour déterminer la concentration nécessaire à l’élimination des agrégats GC.
La méthode peut également être appliquée à la mesure de la susceptibilité antimicrobienne de toutes les bactéries capables de former des agrégats. Portez une attention particulière aux étapes de la lyse pour vous assurer que la lyse est terminée. Sinon, l’analyse de mesure ATP sous-estimera le nombre de bactéries viables.
La visualisation de cette méthode permettra à d’autres chercheurs de suivre et de reproduire cette expérience avec cohérence. Commencez par stries Neisseria gonorrhoeae, ou souches GC, sur gck agar complété avec 1%Kellogg pour une incubation de 16 à 18 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain matin, utilisez un microscope léger pour sélectionner soigneusement les colonies pili-négatives sans bords foncés ou colonies pili-positives avec des bords foncés de chaque plaque, et stries les colonies cueillies sur de nouvelles plaques GCK pour une culture de 16 à 18 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Le lendemain matin, utilisez un applicateur stérile pour recueillir les colonies de GC de chaque assiette et résuspendez chaque écouvillon dans du bouillon chaud complété par 4,2 % de bicarbonate de sodium et 1 % de solution Kellogg. Mesurer la densité optique à 650 nanomètres, ou OD650, pour déterminer la concentration des bactéries en suspension et ajuster la concentration de GC à environ une fois 10 à huit unités de formation de colonie par millilitre. Ensuite, ajouter 99 microlitres de la suspension GC dans les puits individuels d’une plaque de 96 puits et permettre aux bactéries de s’agréger à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant six heures.
À la fin de l’incubation, ajouter un microlitre de ceftriaxone dilué en série à chaque puits en laissant certains puits non traités pour servir de commandes et remettre la plaque à l’incubateur pendant encore 24 heures. Le lendemain, soniquer la suspension dans chaque puits trois fois à 144 watts et 20 kilohertz pendant cinq secondes par sonication et ajouter 100 microlitres de réavenant d’utilisation ATP disponible dans le commerce à chaque puits. Transférez soigneusement 150 microlitres de mélange de chaque puits dans les puits individuels d’une nouvelle microplaque noire de 96 puits et mesurez l’absorption de chaque puits à 560 nanomètres sur un lecteur de plaque.
Ensuite, calculer le taux de survie par le rapport de la lecture obtenue après le traitement antibiotique en série à la lecture des puits non traités. Pour la visualisation des agrégats gc vivants/morts, utilisez un applicateur stérile pour recueillir GC à partir des plaques de culture de nuit et réutiliser le GC dans le milieu GCP préchauffé complété par 1% Kellogg. Mesurez l’OD650 par spectrophotométrie et ajustez la concentration à environ une fois 10 pour les sept unités de formation de colonies par millilitre.
Ensuite, ajoutez 198 microlitres de suspension GC dans des chambres à fond de couverture de huit puits et incubez les chambres à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant six heures. À la fin de l’incubation, traiter les bactéries avec deux microlitres de ceftriaxone par condition d’agrégation et retourner les chambres à l’incubateur pour la période d’incubation expérimentale appropriée. À la fin de l’incubation, ajouter 0,6 microlitres de solution de coloration vivante/morte dans chaque puits et remettre les chambres à l’incubateur pendant 20 minutes supplémentaires.
Ensuite, utilisez un microscope confocal pour obtenir des images de la série Z. Pour mesurer la taille des agrégats GC, ouvrez la première image dans ImageJ et sélectionnez des lignes à main levée pour entourer la zone de chaque agrégation dans l’image. Cliquez sur analyser et mesurer.
La taille des agrégats sera indiquée sous la colonne de zone. Pour quantifier le rapport d’intensité de fluorescence de la coloration vivante à morte dans chaque agrégat, cliquez sur analyser et définir les mesures et vérifiez la densité intégrée dans la fenêtre popup. Cliquez sur OK et cliquez sur l’image, la couleur et l’outil canaux.
Sélectionnez la couleur et canal nt un comme fluorescence pour la coloration des bactéries mortes. Sélectionnez des lignes à main levée pour encercler la zone de chaque agrégation et cliquez sur analyser et mesurer pour obtenir le rapport d’intensité de fluorescence pour chaque agrégat dans la colonne de densité intégrée. Sélectionnez le canal deux pour la fluorescence pour la coloration bactérienne vivante et mesurez l’intensité de fluorescence dans chaque agrégat comme nous venons de le démontrer.
Divisez ensuite les données d’intensité de fluorescence vivante par les données d’intensité de fluorescence morte pour obtenir le rapport d’intensité de fluorescence vivant à mort. Dans cette expérience représentative, les bactéries positives non ventilées de pili positives, agrégées ou agrégées et perturbées de pili positives ont été traitées avec des dilutions périodiques de ceftriaxone avant la mesure de leurs niveaux d’ATP. Le GC préagré a démontré une survie significativement plus élevée que le GC non agrégé ou agrémenté lorsqu’il est traité avec des concentrations égales de ceftriaxone ou plus.
Les souches pili-positives qui forment de plus gros agrégats présentaient les niveaux d’ATP les plus élevés après le traitement à la ceftriaxone par rapport aux souches mutantes. Indépendamment de la souche testée, les taches vivantes/mortes avant le traitement antibiotique ont révélé des bactéries mortes en grande partie situées aux couches externes de la culture, tandis que les GC vivants ont été identifiés principalement dans le noyau des agrégats traités à la ceftriaxone. Comme prévu, les bactéries pili-positives formaient les plus gros agrégats, tandis que les cultures pili-négatives formaient les plus petites.
Notamment, les agrégats pili-positifs étaient encore vivants dans leurs couches fondamentales après traitement antibiotique, tandis que le GC dans les petits agrégats mutants lâches étaient morts. Basé sur la taille et la survie du GC, un graphique de corrélation peut être tracé pour examiner la relation entre la taille d’agrégation et la survie antibiotique des bactéries. La sonication est importante pour s’assurer que l’ATP de chaque bactérie individuelle est libéré dans les agrégats étroitement liés.
Dans le cas contraire, les mesures ne seront pas cohérentes. Il est important de plaquer les bactéries après qu’elles se sont agrégées et sont traitées avec des antibiotiques pour mesurer à la fois la bactérie viable et la bactérie capable de réplication. La technique mesure l’influence de l’agrégation des bactéries sur la susceptibilité aux antibiotiques permettant aux chercheurs de développer de meilleurs médicaments pour le traitement des maladies.
